Effects of illumination on the chlorophyll fluorescence parameters and astaxanthin content of Haematococcus pluvialis
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摘要:
研究了不同光照强度对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响。测定的主要参数有PSⅡ的最大光能转化效率(Fv/Fm)、PSⅡ的潜在活性(Fv/Fo)、PSⅡ的实际光能转化效率(ΦPSⅡ)、光合电子传递效率(ETR)、光化学淬灭(qP)、非光化学淬灭(NPQ)、细胞密度、叶绿素相对含量以及虾青素含量。单因子方差分析结果表明,在整个培养周期中,光照强度对雨生红球藻各叶绿素荧光参数、叶绿素相对含量、细胞密度以及虾青素含量均有显著影响(P < 0.05)。多重比较结果表明,雨生红球藻的最适生长光照强度是50 μmol · m-2 · s-1,当光照强度为300 μmol · m-2 · s-1时单个细胞中的虾青素含量均显著高于其它处理组(P < 0.01),但是单位体积虾青素含量以50 μmol · m-2 · s-1处理组为最高。相关性分析结果表明,在整个培养周期内,叶绿素相对含量与细胞密度均成显著正相关关系。荧光参数(Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR、qP、NPQ)、叶绿素相对含量以及细胞密度与光照强度的相关性则随着培养天数的不同而变化。
Abstract:In this paper, the effects of different illumination on the chlorophyll fluorescence parameters and astaxanthin content of Haematococcus pluvialis were examined. The main parameters determined in the present study including the maximal photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm), the potential activity of PSII (Fv/Fo), the actual photochemical efficiency of PSII in the light (ΦPSⅡ), the electron transport rate (ETR), the photochemical quenching (qP), the non-photochemical quenching (NPQ), cell density, relative chlorophyll content and astaxanthin content. One-way analysis of variance showed that illumination had significant effects on the fluorescence parameters, relative chlorophyll content, cell density and astaxanthin content of H.pluvialis during the entire experimental period (P < 0.05).Multiple comparisons show that the optimal growth illumination of H.pluvialis under the experimental conditions was 50 μmol · m-2 · s-1. The astaxanthin content (μg · cell-1) at 300 μmol · m-2 · s-1 were significantly higher than that in other treatments. But the astaxanthin content (μg · mL-1) at 50 μmol · m-2 · s-1 was highest in all treatments. The analysis of correlations showed that there were significant positive correlations between relative chlorophyll content and cell density during the entire experimental period. Moreover, some fluorescence parameters (Fv/Fm, Fv/Fo, ΦPSⅡ, ETR, qP, NPQ), relative chlorophyll content and cell density all showed significant correlations with illumination, the pattern and strength of the correlations varied with culture age days.
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雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种淡水绿藻,在强光照射条件下能够合成并大量积累具有强抗氧化性的次生类胡萝卜素——虾青素[1]。虾青素(astaxanthin)又称“虾黄素”,是一种从虾蟹外壳、牡蛎及藻类、真菌中发现的红色类胡萝卜素[2]。近年来已有研究表明,虾青素具有极高的经济价值,可用于水产动物及家禽、家畜的养殖,提高产品的品质;天然虾青素有较强的抗氧化活性,具有清除自由基、保护血管、降低胆固醇、护肤等多方面的营养保健作用[3]。雨生红球藻中虾青素的含量最高可达细胞干重的2%~4%,一般为微生物中类胡萝卜素含量的10~50倍,被公认为自然界中天然虾青素含量最高的生物,是用来获取天然虾青素的理想材料[4]。
经研究发现,雨生红球藻积累虾青素是为了保护自身细胞免受氧化作用和高光强的伤害,维持细胞的生存[5-6]。因此,在培养过程中对藻加以胁迫作用能诱导其产生虾青素。光是决定雨生红球藻生长和虾青素最重要因子之一[7]。虽有研究证明该藻可在有机碳源存在的条件下行异养生长,但其生长指标则下降[8]。也有研究证明该藻中虾青素的合成可不依赖光照在黑暗中盐胁迫条件下也可合成虾青素,但其合成速度较慢[9-10]。因此,适宜的光照对促进该藻的生长和虾青素积累是必需的。近年来,有关红球藻积累虾青素的条件有很多报道,高光强被认为是主要的诱导因子[11-12]。
叶绿素荧光是光合作用的良好指标和探针,通过对各种荧光参数的分析,可以得到有关光能利用途径的信息,也可以反映植物受胁迫的情况。在高等植物中进行的大量研究[13-14]表明,叶绿素荧光参数是鉴定高等植物耐逆境能力如耐寒性[15]、耐热性[16]、耐旱性[17]、耐污染[18]、耐O3[19]以及耐盐性[20]等的良好指标之一,具有简单、快速、准确的优点。笔者所在实验室也在此方面作了大量的研究,研究发现,可以用叶绿素相对含量来反映三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)在不同温度下的生长情况,从而确定三角褐指藻的适温范围[21];塔胞藻(Pyramimonas sp.)的某些叶绿素荧光参数可以用来评价该藻对盐胁迫的适应性[22];另外,纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)的荧光参数PSⅡ最大光能转化效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)、PSⅡ实际光能转化效率(ΦPSⅡ)、电子传递效率(ETR)的变化可以反映该藻受重金属胁迫的情况[23]。与传统的测量细胞密度的方法相比,叶绿素荧光法具有简单、快速、准确的优点。
该实验通过叶绿素荧光技术来检测雨生红球藻在不同光照强度下的叶绿素荧光参数的变化规律,揭示叶绿素荧光参数与细胞密度的相关性,以此来检验叶绿素荧光技术在雨生红球藻选育中应用的可行性,并以此探讨高光强对雨生红球藻虾青素累积速率的影响,为进一步大规模提取虾青素提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 藻种
实验所用雨生红球藻藻种由中国科学院海洋研究所提供。
1.2 微藻培养
实验在500 mL的三角烧瓶中进行,均采用f/2培养基,光照强度分别为50、100、150、200、250和300 μmol · m-2 · s-1,每个光照强度设3个平行组,连续光照,培养过程中不充气,每日随机调换三角瓶并摇动2~3次,培养时间为10 d。每天定时取样,进行叶绿素荧光各项参数、叶绿素含量及细胞密度的测定,在指数生长末期收获,测定虾青素含量。
1.3 参数测定
叶绿素荧光参数及叶绿素相对含量的测定均按照梁英等[21]的方法进行。细胞密度用血球计数板测定。虾青素含量的测定按照叶勇和应巧兰[24]的方法进行,采用2种表示方法,即单位体积虾青素含量(μg · mL-1)以及单个细胞虾青素含量(μg ·cell-1)。
1.4 数据的处理
用Sigmaplot 10.0软件作图。用SPSS 11.5软件分别进行单因子方差分析和多重比较(P < 0.05表示差异显著)以及相关性分析。
2. 结果
2.1 光照强度对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响
光照强度对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响见图 1-a~f。由图中可见,随着培养天数的增加,Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR总体上呈先上升后下降的趋势,在培养第6天降至最低值,第7天开始又有所恢复。单因子方差分析结果表明,光照强度对雨生红球藻荧光参数的Fv/Fm、Fv/Fo、光化学淬灭(qP)、非光化学淬灭(NPQ)均有显著影响(P < 0.05),光照强度对雨生红球藻的荧光参数ΦPSⅡ和ETR无显著影响(P>0.05)。多重结果表明,培养天数为1~6 d时,光照强度为50 μmol· m-2 · s-1时雨生红球藻的Fv/Fm、Fv/Fo显著高于其它各组,其它处理组差异不显著(P>0.05)。
表 1给出了雨生红球藻的荧光参数与光照强度之间的相关关系。各荧光参数与光照强度的相关性与培养天数有关,培养天数为1~2 d,雨生红球藻的qP与光照强度呈极显著的正相关关系;培养天数为3~10 d时,qP、NPQ与光照强度呈显著的负相关关系。培养天数为1~7 d,Fv/Fm、Fv/Fo与光照强度呈显著的负相关关系;培养天数为9~10 d时,Fv/Fm、Fv/Fo与光照强度呈显著的正相关关系。培养天数为7~10 d时,雨生红球藻的荧光参数ΦPSⅡ、ETR均与光照强度呈极显著的正相关关系。
表 1 雨生红球藻叶绿素荧光参数、细胞密度及叶绿素相对含量与光照强度的相关系数Table 1. The correlation coefficients of chlorophyll fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content with illumination of H.pluvialisi时间/d
time叶绿素荧光参数chlorophyll fluorescence parameters 细胞密度
cell density叶绿素相对含量
relative chlorophyll contentPSⅡ的最大光能转化效率
Fv/FmPSⅡ的潜在活性
Fv/FoPSⅡ的实际光能转化效率
ΦPSⅡ光合电子传递效率
ETR光化学淬灭
qP非光化学淬灭
NPQ1 -0.900** -0.899** 0.401 0.404 0.632** -0.299 -0.738** -0.512* 2 -0.666** -0.671** -0.371 -0.367 0.764** 0.545* -0.668** -0.502* 3 -0.953** -0.940** -0.347 -0.354 -0.802** -0.872** -0.752** -0.657** 4 -0.945** -0.952** -0.183 -0.173 -0.684** -0.867** -0.869** -0.888** 5 -0.948** -0.948** 0.151 0.152 -0.809** -0.933** -0.839** -0.559* 6 -0.917** -0.917** 0.236 0.231 -0.814** -0.925** -0.830** -0.844** 7 -0.525* -0.533* 0.619** 0.612** -0.685** -0.826** -0.810** -0.733** 8 0.189 0.179 0.723** 0.721** -0.579* -0.746** -0.917** -0.835** 9 0.762** 0.750** 0.878** 0.877** -0.661** -0.848** -0.803** -0.819** 10 0.765** 0.761** 0.896** 0.894** -0.814** -0.904** -0.867** -0.943** 注:* *.相关性极显著(P < 0.01);*.相关性显著(P < 0.05)
Note: * *.very significant correlation (P < 0.01);*.significant correlation(P < 0.05)雨生红球藻的荧光参数与细胞密度之间的相关关系见表 2。可以看出,各荧光参数与细胞密度的相关性与培养天数有关,培养天数为1~2 d,雨生红球藻的qP与细胞密度呈显著的负相关关系;培养天数为3~10 d时,qP、NPQ与细胞密度呈显著的正相关关系。培养天数为1~7 d,Fv/Fm、Fv/Fo与细胞密度呈显著的正相关关系;培养天数为9~10 d时,Fv/Fm、Fv/Fo与细胞密度呈显著的负相关关系。培养天数为8~10 d时,雨生红球藻的荧光参数ΦPSⅡ、ETR均与细胞密度呈极显著的负相关关系。
表 2 雨生红球藻叶绿素荧光参数及叶绿素相对含量与细胞密度的相关系数Table 2. The correlation coefficients of chlorophyll fluorescence parameters and relative chlorophyll content with cell density of H.pluvialisi时间/d
time叶绿素荧光参数chlorophyll fluorescence parameters 叶绿素相对含量
relative chlorophyll contentPSⅡ的最大光能转化效率
Fv/FmPSⅡ的潜在活性
Fv/FoPSⅡ的实际光能转化效率
ΦPSⅡ光合电子传递效率
ETR光化学淬灭
qP非光化学淬灭
NPQ1 0.721** 0.725** -0.481* -0.482* -0.678** 0.162 0.498* 2 0.527* 0.553* 0.203 0.204 -0.567* -0.389 0.598* 3 0.754** 0.765** 0.091 0.094 0.713** 0.800** 0.745** 4 0.842** 0.842** 0.189 0.182 0.593** 0.764** 0.821** 5 0.833** 0.834** -0.261 -0.259 0.816** 0.895** 0.776** 6 0.748** 0.766** -0.166 -0.164 0.758** 0.813** 0.769** 7 0.704** 0.725** -0.267 -0.259 0.467* 0.672** 0.765** 8 -0.167 -0.162 -0.662** -0.663** 0.575* 0.717** 0.915** 9 -0.553* -0.554* -0.625** -0.625** 0.622** 0.702** 0.889** 10 -0.747** -0.746** -0.678** -0.675** 0.670** 0.663** 0.877** 注:* *.相关性极显著(P < 0.01);*.相关性显著(P < 0.05)
Note: * *.very significant correlation (P < 0.01);*.significant correlation (P < 0.05)2.2 光照强度对雨生红球藻叶绿素相对含量及细胞密度的影响
光照强度对雨生红球藻叶绿素相对含量的影响见图 1-g。单因子方差分析结果表明,在1~3 d,光照强度对雨生红球藻叶绿素相对含量的影响均差异不显著(P>0.05),从第4天开始,光照强度对雨生红球藻叶绿素相对含量的影响差异显著(P < 0.05)。与接种时相比,培养结束时,藻液的叶绿素含量及细胞密度均有不同程度的增加。光照强度分别为50、100、150、200、250和300 μmol ·m-2 · s-1时,叶绿素含量增加的倍数分别为3.65、2.42、1.82、1.53、1.28和1.14倍。多重比较结果表明,在1~3 d,各处理组之间叶绿素相对含量差异不显著(P>0.05),从第4天开始,光照强度为50 μmol · m-2 · s-1时的叶绿素相对含量显著高于其它组(P < 0.05),但100~300 μmol · m-2 · s-1处理组之间叶绿素相对含量差异不显著(P>0.05)。
不同光照强度对雨生红球藻细胞密度的影响见图 1-h。单因子方差分析结果表明,在1~5 d,光照强度对雨生红球藻细胞密度的影响均差异不显著(P>0.05),在6~10 d,光照强度对雨生红球藻细胞密度的影响差异显著(P < 0.05)。与接种时相比,培养结束时,藻液的细胞密度均有不同程度的增加。光照强度分别为50、100、150、200、250和300 μmol · m-2 · s-1时,细胞密度增加的倍数分别为1.76、1.46、1.39、1.23、1.22和1.09倍。多重比较结果表明,从第6天开始,光照强度为50 μmol · m-2 · s-1时的细胞密度显著高于其它组(P < 0.05),但100~300 μmol · m-2 · s-1处理组之间叶绿素相对含量差异不显著(P>0.05)。
雨生红球藻的叶绿素相对含量及细胞密度与光照强度之间的相关关系见表 1,可以看出,在整个培养周期中,雨生红球藻的叶绿素相对含量均与光照强度呈显著的负相关关系,细胞密度与光照强度呈极显著的负相关关系。
表 2给出了雨生红球藻的叶绿素相对含量与细胞密度的相关关系,可以看出,在整个培养周期中,雨生红球藻的叶绿素相对含量均与细胞密度呈显著的正相关关系。
2.3 光照强度对雨生红球藻虾青素含量的影响
图 2给出了各光照强度条件下雨生红球藻的虾青素含量,其中图 2-a表示单位体积虾青素含量(μg· mL-1),图 2-b表示单个细胞虾青素含量(μg ·cell-1)。单因子方差分析结果表明,光照强度对雨生红球藻的虾青素含量有显著影响(P < 0.05)。多重比较结果表明,光照强度为300 μmol · m-2 · s-1时单个细胞中的虾青素含量显著高于其它光照强度组(P < 0.01),但是单位体积虾青素含量以光照强度为50 μmol · m-2 · s-1的处理组为最高。
3. 讨论
藻类对光照强度的需求有一个适宜范围(即补偿光照强度和饱和光照强度之间),在此适光范围内,光照强度增加,光合作用加快,从而有利于藻群生物量的增加;达到光饱和强度后,光合作用反而减弱以至受到抑制。光在光合作用中的作用主要有3个方面:(1)提供同化力形成所需要的能量;(2)活化光合作用的关键酶和促进气孔开放;(3)调节光合机构的发育。光照不足时不仅会因同化力的短缺而限制光合碳同化,而且还会由于光合作用的关键酶没有充分活化而限制光合作用的运转。光能不足可以成为光合作用的限制因素,光能过剩也会对光合作用产生不利的影响。当光合机构接受的光能超过它所能利用的量时,光会引起光合活性的降低。这个现象是光合作用的光抑制作用。光抑制的最显著特征是光系统Ⅱ光化学效率降低和光合碳同化的量子效率降低。
该实验结果表明,雨生红球藻生长的最适光照强度为50 μmol · m-2 · s-1,当光照强度升至300 μmol · m-2 · s-1时会有大量虾青素的积累,这与其他学者的研究结果有所差异,如BOUSSIBA等[25]认为有利于其生长的光照强度为85~120 μmol · m-2 ·s-1,最适光照强度为85 μmol · m-2 · s-1,当光照强度升到170 μmol · m-2 · s-1时会有大量虾青素积累;LU等[26]认为雨生红球藻的饱和光照强度为90 μmol · m-2 · s-1,光照强度超过130 μmol ·m-2 · s-1则强烈抑制雨生红球藻的生长;HARKER等[27]认为适合生长的光照强度范围为50~60 μmol · m-2 · s-1,而对于虾青素积累的最适光照强度为1 600 μmol ·m-2 · s-1。后来HARKER等[28]又进一步研究表明低光照强度下(<37 μmol · m-2 · s-1)雨生红球藻细胞的成活率相当高,并且也能获得高的生物量。金传荫等[29]认为60 μmol · m-2 · s-1的光照强度接近最适光强,但张京浦和刘建国[30]认为光照强度控制在160~320 μmol · m-2 · s-1对其生长有利。这些差异产生可能是由于培养条件的不同以及品系间的差异造成的。
传统的确定微藻适光范围的方法是测定不同光照强度条件下的细胞密度,但这种方法比较繁杂,耗时也较多。该实验相关性分析结果表明,雨生红球藻的叶绿素荧光参数(Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR、qP、NPQ)与光照强度之间有一定的相关性,但是此相关性随着培养天数的不同而变化。而叶绿素相对含量在整个培养周期内均与细胞密度呈显著的正相关关系。因此,可以利用叶绿素相对含量的变化来反映雨生红球藻的生长情况及其对光照强度的适应性。与传统的测量细胞密度的方法相比,利用叶绿素荧光法对叶绿素相对含量的测定,具有简单、快速、准确的优点,但目前仅对少量的微藻品种[21-23]进行了这方面的工作,此方法的可靠性还需进行大量的实验研究。
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表 1 雨生红球藻叶绿素荧光参数、细胞密度及叶绿素相对含量与光照强度的相关系数
Table 1 The correlation coefficients of chlorophyll fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content with illumination of H.pluvialisi
时间/d
time叶绿素荧光参数chlorophyll fluorescence parameters 细胞密度
cell density叶绿素相对含量
relative chlorophyll contentPSⅡ的最大光能转化效率
Fv/FmPSⅡ的潜在活性
Fv/FoPSⅡ的实际光能转化效率
ΦPSⅡ光合电子传递效率
ETR光化学淬灭
qP非光化学淬灭
NPQ1 -0.900** -0.899** 0.401 0.404 0.632** -0.299 -0.738** -0.512* 2 -0.666** -0.671** -0.371 -0.367 0.764** 0.545* -0.668** -0.502* 3 -0.953** -0.940** -0.347 -0.354 -0.802** -0.872** -0.752** -0.657** 4 -0.945** -0.952** -0.183 -0.173 -0.684** -0.867** -0.869** -0.888** 5 -0.948** -0.948** 0.151 0.152 -0.809** -0.933** -0.839** -0.559* 6 -0.917** -0.917** 0.236 0.231 -0.814** -0.925** -0.830** -0.844** 7 -0.525* -0.533* 0.619** 0.612** -0.685** -0.826** -0.810** -0.733** 8 0.189 0.179 0.723** 0.721** -0.579* -0.746** -0.917** -0.835** 9 0.762** 0.750** 0.878** 0.877** -0.661** -0.848** -0.803** -0.819** 10 0.765** 0.761** 0.896** 0.894** -0.814** -0.904** -0.867** -0.943** 注:* *.相关性极显著(P < 0.01);*.相关性显著(P < 0.05)
Note: * *.very significant correlation (P < 0.01);*.significant correlation(P < 0.05)表 2 雨生红球藻叶绿素荧光参数及叶绿素相对含量与细胞密度的相关系数
Table 2 The correlation coefficients of chlorophyll fluorescence parameters and relative chlorophyll content with cell density of H.pluvialisi
时间/d
time叶绿素荧光参数chlorophyll fluorescence parameters 叶绿素相对含量
relative chlorophyll contentPSⅡ的最大光能转化效率
Fv/FmPSⅡ的潜在活性
Fv/FoPSⅡ的实际光能转化效率
ΦPSⅡ光合电子传递效率
ETR光化学淬灭
qP非光化学淬灭
NPQ1 0.721** 0.725** -0.481* -0.482* -0.678** 0.162 0.498* 2 0.527* 0.553* 0.203 0.204 -0.567* -0.389 0.598* 3 0.754** 0.765** 0.091 0.094 0.713** 0.800** 0.745** 4 0.842** 0.842** 0.189 0.182 0.593** 0.764** 0.821** 5 0.833** 0.834** -0.261 -0.259 0.816** 0.895** 0.776** 6 0.748** 0.766** -0.166 -0.164 0.758** 0.813** 0.769** 7 0.704** 0.725** -0.267 -0.259 0.467* 0.672** 0.765** 8 -0.167 -0.162 -0.662** -0.663** 0.575* 0.717** 0.915** 9 -0.553* -0.554* -0.625** -0.625** 0.622** 0.702** 0.889** 10 -0.747** -0.746** -0.678** -0.675** 0.670** 0.663** 0.877** 注:* *.相关性极显著(P < 0.01);*.相关性显著(P < 0.05)
Note: * *.very significant correlation (P < 0.01);*.significant correlation (P < 0.05) -
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