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嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价

林潇可 汪玉倩 林美珍 黄东平 苗宇轩 林向民

林潇可, 汪玉倩, 林美珍, 黄东平, 苗宇轩, 林向民. 嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价[J]. 南方水产科学. doi: 10.12131/20220266
引用本文: 林潇可, 汪玉倩, 林美珍, 黄东平, 苗宇轩, 林向民. 嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价[J]. 南方水产科学. doi: 10.12131/20220266
LIN Xiaoke, WANG Yuqian, LIN Meizhen, HUANG Dongping, MIAO Yuxuan, LIN Xiangmin. Immune protective efficacy of recombinant vaccine against Aeromonas hydrophila secreted proteins on zebrafish[J]. South China Fisheries Science. doi: 10.12131/20220266
Citation: LIN Xiaoke, WANG Yuqian, LIN Meizhen, HUANG Dongping, MIAO Yuxuan, LIN Xiangmin. Immune protective efficacy of recombinant vaccine against Aeromonas hydrophila secreted proteins on zebrafish[J]. South China Fisheries Science. doi: 10.12131/20220266

嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价

doi: 10.12131/20220266
基金项目: 福建大学校级自然科学基金(111ZC9051)
详细信息
    作者简介:

    林潇可 (2001—),男,本科生,研究方向为微生物分子生态学。E-mail: 937680443@qq.com

    通讯作者:

    林向民 (1977—),男,教授,博士,研究方向为微生物分子生态学。E-mail: xiangmin@fafu.edu.cn

  • 中图分类号: S 941.42

Immune protective efficacy of recombinant vaccine against Aeromonas hydrophila secreted proteins on zebrafish

  • 摘要: 嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 是一种常见的水产致病菌,可引发人畜鱼共患疾病,对水产养殖业造成严重危害,因此预防其传播和感染是当前亟待解决的问题。为开发高效的潜在亚单位疫苗,并为防治嗜水气单胞菌病害提供理论依据,基于前期的研究结果,选取在嗜水气单胞菌强毒株LP-2中表达丰度较高的8种分泌蛋白 (ORF0322、ORF3982、ORF2874、ORF1767、ORF3984、ORF2546、ORF0472、ORF1609) 作为研究目标,首先利用实时荧光定量PCR (qPCR) 技术对其进行基因表达检测,结果发现这8种分泌蛋白在细胞中均可正常表达;然后将这些蛋白进行基因克隆与表达纯化,并将纯化的重组蛋白免疫斑马鱼 (Danio rerio),连续培养28 d后,发现斑马鱼中相关免疫基因均发生上调,说明这些分泌蛋白可引起宿主发生免疫反应;最后,对这8种分泌蛋白进行免疫保护评价,细菌攻毒实验结果显示,其中6种分泌蛋白 (ORF3982、ORF2874、ORF1767、ORF3984、ORF0472、ORF1609) 的相对免疫保护率 (Relative immune protection rate, RPS) 大于50%,可作为候选疫苗开发。
  • 图  1  8种分泌蛋白在嗜水气单胞菌LP-2菌株中的mRNA 表达结果

    Figure  1.  mRNA expression results of eight excreted proteins in LP-2 strain

    图  2  8个目的基因PCR扩增结果

    Figure  2.  PCR amplification results of eight target genes

    图  3  高表达重组菌株菌液PCR验证结果

    Figure  3.  PCR verification results of recombinant strain with high expression

    图  4  纯化蛋白SDS-PAGE 结果

    Figure  4.  SDS-PAGE results of purified protein

    图  5  斑马鱼的免疫相关基因表达结果

    注:*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.005。

    Figure  5.  Expression results of immune-related genes in zebrafish

    Note: *. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.005。

    图  6  攻毒后注射免疫下接种的斑马鱼的累积成活率及相对免疫保护率

    Figure  6.  Cumulative survival rate and relative immune protection rate (RPS) of zebrafish inoculated with injection immunization after challenge

    表  1  本研究中选取的分泌蛋白及引物序列

    Table  1.   Secreted proteins and their primer pairs used in this study

    序号
    No.
    基因
    Gene
    蛋白质
    Protein
    核苷酸长度
    Nucleotide length/bp
    蛋白描述
    Protein description­­
    引物序列 (5'—3')
    Primer sequence (5'−3')
    1 orf0322 ORF0322 1 065 假定蛋白
    Hypothetical protein
    F: GGGGAATTCATGAGGAATCAGGCTGTCATTTTGT
    R: CCCAAGCTTTCAGGGCCTGGTGGGGGCG
    2 orf3982 ORF3982 543 P型菌毛蛋白 PapA F: AAAGAATTCATGAAAGCTAACAAGAATCTGGTTG
    R: CCCAAGCTTTTACTCGTAGGAGAGAGTAAAGTTG
    3 orf2874 ORF2874 1 866 溶细胞素和溶血素、溶血素、
    孔道形成蛋白
    Cytolysin and hemolysin,
    HlyA, Pore forming
    F: GGGGAATTCATGAAAAACAAAAAACCACGCAAAT
    R: CCCAAGCTTTCAGTGACTGGCCGGTGGC
    4 orf1767 ORF1767 1 482 假定蛋白
    Hypothetical protein
    F: AAAGAATTCATGAAGACTTTTAAGGTTTCAATTA
    R: AAAAGGCTTTTAGCGGTTGACGTATTCCTCAA
    5 orf3984 ORF3984 2 748 微生物胶原酶
    Microbial collagenase
    F: AAAGAATTCATGAACAATCTGGGTACCAGGTT
    R: AAAAGGCTTTCAGTGGGAGGAGTCGTTGG
    6 orf2546 ORF2546 519 宿主细胞蛋白 Hcp F: CCCGAATTCATGCCAACTCCATGTTATATCAGCA
    R: GGGAAGCTTTTACGCCTCGATCGGCGCA
    7 orf0472 ORF0472 930 溶血素 Hemolysin F: GGGGAATTCATGTTTGGCGACAGCCTCTCC
    R: CCCAAGCTTTCAGTGGGCGAGGAACTCGTAT
    8 orf1609 ORF1609 1 875 假定细胞外丝氨酸蛋白酶
    Putative extracellular serine protease
    F: GGGGAATTCATGAGAAAAACATCGTTAGCGTTGG
    R: CCCAAGCTTTCATGAGCGGGCGGCATCG
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    表  2  免疫相关基因表达的引物

    Table  2.   Primers for expression of immune-related genes

    序号
    No.
    基因
    Gene
    引物序列 (5'—3')
    Primer sequence (5'−3')
    1 Lyz F: GATTTGAGGGATTCTCCATTGG
    R: CCGTAGTCCTTCCCCGTATCA
    2 IL1β F: TGGACTTCGCAGCACAAAATG
    R: GTTCACTTCACGCTCTTGGATC
    3 MHC I F: GGAGTTCACCTTGCTTATGC
    R: CCCTCTGACCCATTCTTGT
    4 MHC II F: TGACTCAACTGTCCGTGATA
    R: CCATTAGCCATCTCCATAGTG
    5 IL8 F: GTCGCTGCATTGAAACAGAA
    R: CTTAACCCATGGAGCAGACC
    6 IL10 F: TCACGTCATGAACGAGATCC
    R: CCTCTTGCATTTCACCATATCC
    7 IL15 F: ACAGAGGAAGAAGCCTACAG
    R: GCGATGAAGACGAGAAAGAC
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-10-06
  • 修回日期:  2023-02-15
  • 录用日期:  2023-03-21
  • 网络出版日期:  2023-03-27

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