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大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究

李张婵 施慧 许文军 何杰 谢建军 王庚申 汪玮

李张婵, 施慧, 许文军, 何杰, 谢建军, 王庚申, 汪玮. 大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 南方水产科学. doi: 10.12131/20220251
引用本文: 李张婵, 施慧, 许文军, 何杰, 谢建军, 王庚申, 汪玮. 大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 南方水产科学. doi: 10.12131/20220251
LI Zhangchan, SHI Hui, XU Wenjun, HE Jie, XIE Jianjun, WANG Gengshen, WANG Wei. Screening of antagonistic bacteria against visceral white-spots disease of Larimichthys crocea and preliminary study on its biological characteristics[J]. South China Fisheries Science. doi: 10.12131/20220251
Citation: LI Zhangchan, SHI Hui, XU Wenjun, HE Jie, XIE Jianjun, WANG Gengshen, WANG Wei. Screening of antagonistic bacteria against visceral white-spots disease of Larimichthys crocea and preliminary study on its biological characteristics[J]. South China Fisheries Science. doi: 10.12131/20220251

大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究

doi: 10.12131/20220251
基金项目: 浙江省基础公益研究计划项目 (LGN21C190006);浙江省农业农村厅协同创新项目 (2020XTTGSC04);国家重点研发计划项目 (2020YFD0900803);2020年市级第二批现代渔业发展专项资金 (舟财农〔2020〕21号)
详细信息
    作者简介:

    李张婵 (1997—),女,硕士研究生,研究方向为海水养殖病害。E-mail:l97091843@163.com

    通讯作者:

    施 慧 (1978—),女,高级工程师,硕士,研究方向为海水养殖病害。E-mail: huishi2002@126.com

  • 中图分类号: S942.3

Screening of antagonistic bacteria against visceral white-spots disease of Larimichthys crocea and preliminary study on its biological characteristics

  • 摘要: 为实现大黄鱼 (Larimichthys crocea) 内脏白点病的生物防控,推进水产养殖用药减量,从健康大黄鱼肠道中筛选出对大黄鱼内脏白点病病原菌杀香鱼假单胞菌 (Pseudomonas plecoglossicid) 有拮抗作用的益生菌。采用琼脂扩散法筛选菌株,通过生理生化特征以及分子生物学分析,对菌株进行鉴定,并评价菌株的溶血性、药敏性、安全性、产酶能力及抗菌广谱性。从健康大黄鱼肠道中初步分离出37株潜在益生菌,通过拮抗试验筛选出3株具有拮抗效果的菌株,分别命名为P1-17、P2-33和P3-11。通过生理生化特性及16S rRNA 测序分析,菌株P1-17和P2-33鉴定为贝莱斯芽胞杆菌 (Bacillus velezensis);菌株P3-11鉴定为粪肠球菌 (Enterococcus faecalis);溶血性试验和药敏试验结果表明3株菌均无显著溶血圈,且所含耐药因子较少,不具备潜在致病性;人工回感试验证实3株拮抗菌对健康大黄鱼无致病性;抗菌谱测定结果表明2株芽孢杆菌对溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌 (V. harveyi)、美人鱼发光杆菌 (Photobacterium damselae) 等多种水产病原菌具有拮抗效果,同时2株芽孢杆菌具有产淀粉酶和蛋白酶的能力;而该株粪肠球菌只对杀香鱼假单胞菌有拮抗作用,研究结果可为后续大黄鱼肠道益生菌的筛选和应用提供科学依据。
  • 图  1  拮抗菌P1-17、P2-33、P3-11菌落形态

    Figure  1.  Colony morphology diagram of antagonistic bacteria P1-17, P2-33 and P3-11

    图  2  拮抗菌P1-17、P2-33、P3-11革兰氏染色图

    Figure  2.  Gram staining of antagonistic bacteria P1-17, P2-33 and P3-11

    图  3  基于菌株P1-17、P2-33及相关菌株16S rRNA序列的系统发育树

    注:括号中的序号代表菌株的GenBank登录号; 分支点上的数字代表bootstrap值; 标尺刻度代表碱基替代率。

    Figure  3.  Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of Strains P1-17, P2-33 and other related strains

    The sequence number in the bracket is the GenBank accession number of the strain; the numbers at the node are the bootstrap values; the scale bar means nucleotide substitution ratio.

    图  4  基于菌株P3-11及相关菌株16S rRNA序列的系统发育树

    Figure  4.  Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of Strain P3-11 and other related strains

    表  1  菌株P1-17、P2-33、P3-11的生理生化特征

    Table  1.   Physiological and biochemical characteristics of Strains P1-17, P2-33 and P3-11

    鉴定项目 Tested item菌株 Strain
    P1-17P2-33P3-11
    蛋白胨水 peptone water + + +
    蔗糖 Sucrose +
    甘露糖 Mannose
    阿拉伯糖 Pectinose + + +
    乳糖 Lactose
    葡萄糖氧化发酵试验 OF
    邻硝基苯-半乳糖苷 o-nitrophenyl-galactosidase
    柠檬酸盐 Citrate
    硫化氢 H2S
    尿素酶 Urease
    VP试验 Voges-Proskauer test + + +
    明胶液化 Gelatin Liquefaction + + +
    吲哚试验 Indole test +
    葡萄糖 Glucose +
    甘露醇 Mannitol +
    肌醇 Inositol +
    山梨醇 Sorbitol +
    鼠李糖 Rhamnose
    密二糖 Melibiose
    苦杏仁苷 Amygdalin +
    注:+. 阳性;−. 阴性。
    Note: +. Positive; –. Negative.
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    表  2  菌株P1-17、P2-33、 P3-11的药敏特性

    Table  2.   Antibiotic sensitivity of Strains P1-17, P2-33 and P3-11

    抗菌药物种类
    Types of Antibacterial
    药物名称
    Drug
    纸片含药量
    Content/
    (μg·片−1)
    抑菌圈直径/敏感性
    Diameter of inhibition zone (mm)/Susceptibility
    P1-17P2-33P3-11
    青霉素类
    Penicillins
    氨苄西林 Ampicillin 10 27.41/S 22.34/S 14.56/R
    青霉素 Penicillin 10 32.65/S 27.54/S 21.37/S
    阿莫西林 Amoxicillin 20 28.57/S 18.26/S 16.22/I
    新生霉素 Neomycin 30 28.57/S 28.57/S 17.30/S
    头孢菌素类
    Cephalosporins
    头孢噻肟 Cefotaxime 30 37.58/S 31.48/S 0/R
    头孢曲松 Ceftriaxone 30 37.45/S 33.56/S 0/R
    喹诺酮类
    Quinolones
    诺氟沙星 Norfloxacin 10 32.36/S 31.43/S 19/S
    依诺沙星 Enoxacin 10 32.54/S 31.64/S 22/S
    环丙沙星 Ciprofloxacin 5 41.05/S 36.55/S 24/S
    氧氟沙星 Ofloxacin 5 41.24/S 39.15/S 25/S
    左氧氟沙 Levofloxacin 5 39.04/S 38.86/S 19/S
    恩诺沙星 Enrofloxacine 10 40.32/S 36.58/S 24/I
    洛美沙星 Lomefloxacin 10 40.27/S 38.36/S 21/S
    磺胺类
    Sulfonamides
    磺胺异恶唑 Sulfisoxazole 300 20.34/S 18.87/S 0/R
    复方新诺明 Cotrimoxazole 25 34.66/S 32.78/S 0/R
    四环素类
    Tetracyclines
    四环素 Tetracycline 30 25.16/S 23.36/S 15/I
    多西环素 Doxycycline 30 33.27/S 33.27/S 26/S
    大环内酯类
    Macrolides
    阿奇霉素 Azithromycin 15 30.26/S 27.67/S 13/R
    罗红霉素 Roxithromycin 15 37.57/S 33.35/S 14/R
    氨基苷类
    Aminoglycosides
    链霉素 Streptomycin 10 26.26/S 25.86/S 0/R
    卡那霉素 Kanamycin 30 35.06/S 34.89/S 0/R
    丁胺卡那 Amikacin 30 37.34/S 31.57/S 0/R
    庆大霉素 Gentamycin 10 34.36/S 31.68/S 0/R
    妥布霉素 Tobramycin 10 36.02/S 34.08/S 0/R
    氯霉素类
    Chloramphenicol
    氯霉素 Chloramphenicol 30 35.24/S 35.24/S 18/I
    氟苯尼考 Florfenicol 30 38.31/S 33.65/S 22/S
    肽类抗生素
    Peptides
    万古霉素 Vancomycin 30 30.10/S 28.35/S 20/S
    多黏菌素 B Polymyxin B 300IU 17.28/S 14.07/S 0/R
    多烯类抗真菌抗生素
    Polyeneantifungal
    制霉菌素 Nystatin 100 10.57/R 11.21/R 0/R
    注:S. 高度敏感;I. 中度敏感;R. 耐药。
    Note: S. Sensitive; I. Intermediate sensitive; R. Resistance.
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    表  3  拮抗菌株产酶能力

    Table  3.   Enzyme production ability of antagonistic strains

    菌株名称
    Strain
    Dh/Dc
    蛋白酶
    Protease
    脂肪酶
    Lipase
    淀粉酶
    Amylase
    P1-174.2304.20
    P2-333.8204.46
    P3-11000
    注:Dh/Dc 表示水解圈直径|(Dh)|与菌落直径|(Dc)|之比。
    Note: Dh/Dc indicates the hydrolysis circle diameter (Dh) and the ratio of the colony diameter (Dc).
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    表  4  分离菌株对杀香鱼假单胞菌的拮抗试验

    Table  4.   Antagonism test of isolated strains against P. plecoglossicida

    菌株
    Strain
    抑菌圈直径
    Diameter of inhibition zone/mm
    P1-17P2-33P3-11
    杀香鱼假单胞菌 1303001
    Pseudomonas plecoglossicida 1303001
    10.24±0.41 9.86±0.35 12.57±0.64
    杀香鱼假单胞菌 1303002
    P. plecoglossicida 1303002
    10.53±0.72 10.18±1.14 12.6±0.83
    杀香鱼假单胞菌 1306002
    P. plecoglossicida 1306002
    9.76±0.47 9.58±0.34 11.47±0.54
    杀香鱼假单胞菌 202010001
    P. plecoglossicida 202010001
    10.43±1.40 9.76±0.65 11.85±1.21
    杀香鱼假单胞菌 202010002
    P. plecoglossicida 202010002
    9.45±1.52 9.25±0.74 10.68±0.36
    杀香鱼假单胞菌 202105001
    P. plecoglossicida 202105001
    9.18±0.64 8.74±1.32 10.46±0.54
    杀香鱼假单胞菌 202105002
    P. plecoglossicida 202105002
    10.65±0.22 9.65±0.83 12.34±1.12
    杀香鱼假单胞菌 202105003
    P. plecoglossicida 202105003
    9.34±0.72 9.05±0.63 11.38±1.43
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    表  5  拮抗菌对其他致病菌的拮抗试验

    Table  5.   Antagonism test of antagonistic bacteria against other pathogenic bacteria

    菌株
    Strain
    抑菌圈直径
    Diameter of inhibition zone/mm
    P1-17P2-33P3-11
    溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus 10.39±0.67 7.78±0.56 0
    哈维氏弧菌 V. harveyi 10.65±1.54 10.34±1.56 0
    副溶血弧菌 V. parahaemolyticus 11.57±0.34 11.25±0.42 0
    美人鱼发光杆菌 Photobacterium damselae 15.13±0.24 14.96±0.53 0
    嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 19.64±1.56 16.85±0.37 0
    迟缓爱德华氏菌 Edwardsiella tarda 21.85±0.24 20.83±0.46 0
    注:“0”表示无拮抗作用。
    Note: "0" indicates no antagonism.
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-09-21
  • 修回日期:  2022-11-04
  • 录用日期:  2023-01-04
  • 网络出版日期:  2023-01-09

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