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岩藻黄质关键前体新黄质的代谢工程合成

张桂林 张亚亭 姜宏 刘振 毛相朝

张桂林, 张亚亭, 姜宏, 刘振, 毛相朝. 岩藻黄质关键前体新黄质的代谢工程合成[J]. 南方水产科学, 2022, 18(2): 57-65. doi: 10.12131/20210316
引用本文: 张桂林, 张亚亭, 姜宏, 刘振, 毛相朝. 岩藻黄质关键前体新黄质的代谢工程合成[J]. 南方水产科学, 2022, 18(2): 57-65. doi: 10.12131/20210316
ZHANG Guilin, ZHANG Yating, JIANG Hong, LIU Zhen, MAO Xiangzhao. Metabolic engineering synthesis of neoxanthin, a key precursor of fucoxanthin[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(2): 57-65. doi: 10.12131/20210316
Citation: ZHANG Guilin, ZHANG Yating, JIANG Hong, LIU Zhen, MAO Xiangzhao. Metabolic engineering synthesis of neoxanthin, a key precursor of fucoxanthin[J]. South China Fisheries Science, 2022, 18(2): 57-65. doi: 10.12131/20210316

岩藻黄质关键前体新黄质的代谢工程合成

doi: 10.12131/20210316
基金项目: 国家重点研发计划项目 (2019YFD0901904)
详细信息
    作者简介:

    张桂林 (1996—),男,硕士研究生,研究方向为微生物代谢工程。E-mail: 2571258329@qq.com

    通讯作者:

    刘 振 (1981—),男,副教授,博士,从事海洋食品合成生物学研究。E-mail: liuzhenyq@ouc.edu.cn

  • 中图分类号: Q 812

Metabolic engineering synthesis of neoxanthin, a key precursor of fucoxanthin

  • 摘要: 岩藻黄质是海洋藻类中常见的叶黄素之一,尤其在褐藻中含量较高,具有抑菌、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病、抗肿瘤、调节肠道菌群和抗器官纤维化等多种生理活性。新黄质是岩藻黄质的可能前体物质,首次在大肠杆菌 (Escherichia coli) 中构建新黄质合成途径,首先构建了pTrc99a-crtEBIYZ质粒,该质粒携带5个来自于菠萝泛菌 (Pantoea ananatis) 的基因crtEcrtBcrtIcrtYcrtZ,编码的蛋白分别是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶和β-胡萝卜素羟化酶。将该质粒转入大肠杆菌中,得到了产玉米黄质的工程菌E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ,玉米黄质产量 (细胞干质量,下同) 为0.70 mg·g−1。以产玉米黄质工程菌为宿主,将来自三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum) 的ZEP3基因去信号肽之后转入,得到产紫黄质的工程菌E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3。在紫黄质工程菌E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3的基础上转入新黄质合酶基因NSY,成功获得了产新黄质的工程菌E. coli BL21 NEO,新黄质产量为99.27 μg·g−1 ,紫黄质产量为150.30 μg·g−1,玉米黄质产量为119.77 μg·g−1
  • 图  1  新黄质与岩藻黄质的结构式

    Figure  1.  Structural formula of neoxanthin and fucoxanthin

    图  2  新黄质合成途径

    Figure  2.  Synthetic pathway of neoxanthin

    图  3  番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质工程菌的构建

    Figure  3.  Construction of lycopene, β-carotene and zeaxanthin engineered bacteria

    图  4  E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3工程菌发酵产物HPLC结果

    Figure  4.  HPLC results of fermentation products of E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3

    图  5  E. coli BL21 NEO工程菌HPLC检测结果

    Figure  5.  Detection of E. coli BL21 NEO by HPLC

    图  6  E. coli BL21 NEO工程菌新黄质 (a) 和紫黄质 (b) 的质谱检测结果

    Figure  6.  Detection results of neoxanthin (a) and violaxanthin (b) in E. coli BL21 NEO by MS

    表  1  本文所用菌株

    Table  1.   Strains in this study

    菌株
    Strain
    基因型
    Genotype
    功能
    Function
    来源
    Source
    TreliefTM5α化学感受态细胞
    TreliefTM5α Chemically competent cell
    F, φ80dlacZ Δ M15, Δ (lacZYA-argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK, mK+), phoA, supE44, λ, thi-1, gyrA96, relA1 质粒克隆 擎科生物
    BL21 (DE3) 化学感受态细胞
    BL21 (DE3) Chemically competent cell
    F, ompT, hsdSB (rB, mB), gal, dcm (DE3) 高效表达 擎科生物
    菠萝泛菌 Pantoea ananatis crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ 获取crtEcrtB
    crtIcrtYcrtZ基因
    中国工业微生物菌
    种保藏管理中心
    E. coli BL21 pTrc99a-crtEBI lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-TrrnB, AmpR 生产番茄红素 本实验构建
    E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-TrrnB, AmpR 生产β-胡萝卜素 本实验构建
    E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, AmpR 生产玉米黄质 本实验构建
    E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3 lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, PT7-QZEP3-TT7, AmpR, CmR 生产紫黄质 本实验构建
    E. coli BL21 NEO lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, PT7-QZEP3-NSY-TT7, AmpR, CmR 生产新黄质 本实验构建
    注:crtE. 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因;crtB. 八氢番茄红素合成酶基因;crtI. 八氢番茄红素脱氢酶基因;crtY. 番茄红素环化酶基因;crtZ. β-胡萝卜素羟化酶基因;ZEP3. 玉米黄质环氧化酶基因;QZEP3. 去除叶绿体转运肽的玉米黄质环氧化酶基因;NSY. 新黄质合酶基因;后表同此。 Note: crtE. The gene of Geranylgeranyl diphosphate synthase; crtB. The gene of phytoene synthase; crtI. The gene of phytoene desaturase; crtY. The gene of Lycopene cyclase; crtZ. The gene of β-carotene hydroxylase; ZEP3. The gene of zeaxanthin epoxidase; QZEP3. The gene of zeaxanthin epoxidase without chloroplast transport peptide; NSY. The gene of neoxanthin synthase. The same case below.
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    表  2  本文所用质粒

    Table  2.   Plasmids in this study

    质粒   
    Plasmid   
    基因型   
    Genotype   
    功能
    Function
    来源
    Source
    pTrc99a lacI, Ptrc-TrrnB, AmpR 载体 本实验室
    pTrc99a-crtEBI lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-TrrnB, AmpR E. coli BL21中生产番茄红素 本实验构建
    pTrc99a-crtEBIY lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-TrrnB, AmpR E. coli BL21中生产β-胡萝卜素 本实验构建
    pTrc99a-crtEBIYZ lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, AmpR E. coli BL21中生产玉米黄质 本实验构建
    pACYCDuet-1 lacI, PT7-TT7, CmR 载体 本实验室
    pACYCDuet-1-ZEP3 lacI, PT7-ZEP3-TT7, CmR E. coli BL21中生产紫黄质 本实验构建
    pACYCDuet-1-QZEP3 lacI, PT7-QZEP3-TT7, CmR E. coli BL21中生产紫黄质 本实验构建
    pACYCDuet-1-QZEP3-NSY lacI, PT7-QZEP3-NSY-TT7, CmR E. coli BL21中生产新黄质 本实验构建
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    表  3  引物序列

    Table  3.   Primer sequence

    引物名称
    Primer
    序列 (5'—3')
    Sequence (5'—3')
    crtE-F CCGGAATTCATGACGGTCTGCGCAAAA
    crtE-R TCCCCCGGGTTAACTGACGGCAGCGAG
    crtB-F TCCCCCGGGCAGGAACAGATGAATAATCCGTCGTTA
    crtB-R CTAGTCTAGACTAGAGCGGGCGCTGCCA
    crtI-F CTAGTCTAGACAGGAACAGATGAAACCAACTACGGTA
    crtI-R CCCAAGCTTTCATATCAGATCCTCCAG
    crtY-F GAGGATCTGATATGAAAGCTTCACAGGAAACAGACCATGCAACCGCATTAT
    crtY-R GGTCTGTTTCCTGTGTTAACGATGAGTCGT
    crtZ-F CACAGGAAACAGACCATGTTGTGGATTTGG
    crtZ-R TCCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTACTTCCCGGATGCGG
    ZEP3-F CACCACAGCCAGGATCCTATGAGTGAAGAAAAAGTGGA
    ZEP3-R TGCGGCCGCAAGCTTTTACAGGCCTGCTGC
    NSY-F AGATATACATATGGCAGATCTATGGAAACCCTGCTGAAAC
    NSY-R GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTACAGGCTTTCAATTGC
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    表  4  YMC Carotenoid流动相条件

    Table  4.   YMC Carotenoid mobile phase conditions

    t/min甲醇比例
    Methanol proportion/%
    甲基叔丁醚比例
    Methyl tertiary butyl ether/%
    09010
    159010
    254060
    359010
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-10-29
  • 修回日期:  2022-01-14
  • 录用日期:  2022-01-20
  • 网络出版日期:  2022-02-07
  • 刊出日期:  2022-04-01

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