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大菱鲆弧菌耐药谱、耐药基因检测和ERIC-PCR分型分析

沈飞 翟玉菲 王浩 吕利群

沈飞, 翟玉菲, 王浩, 吕利群. 大菱鲆弧菌耐药谱、耐药基因检测和ERIC-PCR分型分析[J]. 南方水产科学. doi: 10.12131/20210138
引用本文: 沈飞, 翟玉菲, 王浩, 吕利群. 大菱鲆弧菌耐药谱、耐药基因检测和ERIC-PCR分型分析[J]. 南方水产科学. doi: 10.12131/20210138
SHEN Fei, ZHAI Yufei, WANG Hao, LÜ Liqun. Antimicrobial spectrum, resistance gene detection and ERIC-PCR genotyping of Vibrio scophthalmi[J]. South China Fisheries Science. doi: 10.12131/20210138
Citation: SHEN Fei, ZHAI Yufei, WANG Hao, LÜ Liqun. Antimicrobial spectrum, resistance gene detection and ERIC-PCR genotyping of Vibrio scophthalmi[J]. South China Fisheries Science. doi: 10.12131/20210138

大菱鲆弧菌耐药谱、耐药基因检测和ERIC-PCR分型分析

doi: 10.12131/20210138
基金项目: 财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系资助 (CARS-45-19)
详细信息
    作者简介:

    沈飞:沈 飞 (1997—),男,硕士研究生,研究方向为水产病害与免疫研究。E-mail: 1605615033@qq.com

    通讯作者:

    吕利群 (1971—),男,博士,教授,从事水产病害防治研究。E-mail: lqlv@shou.edu.cn

  • 中图分类号: S 942

Antimicrobial spectrum, resistance gene detection and ERIC-PCR genotyping of Vibrio scophthalmi

  • 摘要: 2020年6—10月,从辽宁地区患病大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 体内共分离到394株菌株。基于16S rRNA序列鉴定分离株,采用微量稀释法分析随机挑选的18株大菱鲆弧菌 (Vibrio scophthalmi) 对8种抗生素的敏感性,检测其耐药基因携带情况,并基于ERIC-PCR进行分型研究。结果显示,分离株以弧菌属为主,有232株 (58.88%),其中大菱鲆弧菌117株 (29.70%)。经rpoD序列比对确定的18株大菱鲆弧菌对硫酸新霉素、氟甲喹和盐酸多西环素不耐药,对其他5种抗菌药物有不同的耐药率,多重耐药率为66.7%。18株大菱鲆弧菌共检测到酰胺醇类耐药基因floR (61.11%) 和cmlA (66.67%)、磺胺类耐药基因sul2 (55.56%)、喹诺酮类耐药基因qnrA (50%) 和qnrS (5.56%) 5种耐药基因,未检测到氨基糖苷类和四环素类耐药基因。酰胺醇类耐药基因与耐药表型符合率为88.89%,有一定的相关性。磺胺类耐药基因与耐药表型符合率次之,为50%,喹诺酮类符合率最低为33.33%。ERIC-PCR将该18株分为4个亚型,Ⅰ型 (44.44%) 和Ⅲ型 (44.44%) 为主要谱型,与耐药表型或耐药基因无明显相关性。根据药敏结果,防治辽宁地区大菱鲆弧菌建议首选盐酸多西环素。
  • 图  1  18株大菱鲆弧菌rpoD基因PCR扩增结果

    M. DL2000 DNA Marker; 1~18. Vs1~18; N. 阴性对照

    Figure  1.  PCR amplification product of rpoD in 18 strains of V. scophthalmi

    M. DL2000 DNA Marker; 1 to 18. Vs1 to Vs18; N. Negative control

    图  2  基于弧菌rpoD序列相似性构建的系统发育进化树

    Figure  2.  Phylogenetic tree constructed from rpoD sequence of Vibrio

    图  3  大菱鲆弧菌分离株ERIC-PCR指纹图谱与UPGMA树状图

    Figure  3.  Genetic diversity diagram based on enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR and UPGMA dendrogram of V. scophthalmi strains

    表  1  PCR引物

    Table  1.   Primers used for PCR

    目的基因
    Target gene
    引物序列 (5'—3')
    Primer sequence
    产物长度
    Product size/bp
    参考文献
    Reference
    16S rRNA 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
    1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT
    约1 500 [8]
    rpoD F:ATAGAAATAACCAGACGTAAGTTNGCYTCNACCATYTCYTTYT
    R:ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT
    780 [16]
    氨基糖苷类耐药基因
    Aminoglycoside resistance gene
    aph (3')-Ⅰa F: TGACTGGGCACAACAGACAA R: CGGCGATACCGTAAAGCAC 677 [19]
    aac (6') -Ⅰb F: ATGACCTTGCCATGCTCTATGA
    R: CGAATGCCTGGCGTGTTT
    486 [19]
    aac (3')-Ⅰb F: ACCCTACGAGGAGACTCTGAATG
    R: CCAAGCATCGGCATCTCATA
    384 [19]
    酰胺醇类耐药基因
    Amide alcohol resistance gene
    floR F: GCTTCACTGGCGATGGATATTTA
    R: CAAAGTAATGAATATCGCCTGCC
    450 [20]
    catA F: AAAAATTATATCCGACTCTCTTA
    R: CTTGAATCGATAAGGGAATATAG
    420 [20]
    cmlA F: TGCCAGCAGTGCCGTTTAT
    R: CACCGCCCAAGCAGAAGTA
    500 [20]
    四环素类耐药基因
    Tetracycline resistance gene
    tetA F: TTTCGGGTTCGGGATGGT
    R: CAGGCAGAGCAAGTAGAGGG
    915 [21]
    tetC F: CTGGGCTGCTTCCTAATGC
    R: AGCTGTCCCTGATGGTCGT
    480 [21]
    tetM F: GAGGTCCGTCTGAACTTTGCG
    R: AGAAAGGATTTGGCGGCACT
    580 [21]
    磺胺类耐药基因
    Sulfonamide resistance gene
    sul1 F: CATTGCCTGGTTGCTTCAT
    R: ATCCGACTCGCAGCATTT
    238 [21]
    sul2 F: CATCATTTTCGGCATCGTC
    R: TCTTGCGGTTTCTTTCAGC
    793 [21]
    sul3 F: AGATGTGATTGATTTGGGAGC
    R: TAGTTGTTTCTGGATTAGAGCCT
    443 [21]
    喹诺酮类耐药基因
    Quinolone resistance gene
    qnrA F: ATTTCTCACGCCAGGATTTG
    R: GATCGGCAAAGGTCAGGTCA
    516 [18]
    qnrB F: GATCGTGAAAGCCAGAAAGG
    R: ACGATGCCTGGTAGTTGTCC
    469 [18]
    qnrS F: ACGACATTCGTCAACTGCAA
    R: TAAATTGGCACCCTGTAGGC
    417 [18]
    aac (6')-Ⅰb-cr F: TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA
    R: CTCGAATGCCTGGCGTGTTT
    523 [18]
    oqxAB F: CCCTGGACCGCACATAAAG
    R: AAAGAACAAGATTCACCGCAAC
    482 [18]
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    表  2  基于16S rRNA测序的394株分离株鉴定结果

    Table  2.   Identification result of 394 strains based on 16S rRNA sequencing


    Genus

    Species
    6月
    Jun.
    7月
    Jul.
    8月
    Aug.
    9月
    Sep.
    10月
    Oct.
    合计
    Total
    弧菌属 Vibrio 大菱鲆弧菌 V. scophthalmi 13 10 35 26 33 117 (29.70%)
    溶藻弧菌 V. alginolyticus 0 1 23 11 0 35 (8.89%)
    V. atlanticus 2 3 1 6 3 15 (3.81%)
    嗜环弧菌 V. cyclitrophicus 0 0 0 4 6 10 (2.54%)
    V. toranzoniae 1 2 1 7 4 15 (3.81%)
    其他 Other 7 3 2 17 11 40 (10.15%)
    假单胞菌属 Pseudomonas 8 3 8 11 16 46 (11.68%)
    假交替单胞菌属 Pseudoalteromonas 0 5 12 18 0 35 (8.88%)
    其他 Other 14 17 10 33 7 81 (20.56%)
    合计 Total 45 44 92 133 80 394
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    表  3  18株大菱鲆弧菌的药物敏感性

    Table  3.   Drug sensitivity of 18 V. scophthalmi strains

    分离株
    Isolate
    恩诺沙星
    ENR
    硫酸新霉素
    NEO
    甲砜霉素
    TAP
    氟苯尼考
    FFC
    盐酸多西环素
    DO
    氟甲喹
    FLU
    磺胺间甲氧嘧啶钠
    SMM
    磺胺甲恶唑+甲氧苄啶
    SMZ+TMP
    Vs1SISSSSSS
    Vs2SSRRSSRS
    Vs3SSSSSSRR
    Vs4SSSSSSSS
    Vs5SSSSSSRS
    Vs6SISSSSSS
    Vs7SSSSSSRR
    Vs8SSSSSSSS
    Vs9RIRRSSSS
    Vs10RSRRSSSS
    Vs11SIRRSSSS
    Vs12RSRRSSSS
    Vs13SISSSSRR
    Vs14SISSSSSS
    Vs15ISRRSSRR
    Vs16RSRRSSSS
    Vs17RIRRSSSS
    Vs18RIRRSSSS
    注:S. 敏感;I. 中敏;R. 耐药 Note: S. Sensitive; I. Intermediary; R. Resistant
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    表  4  大菱鲆弧菌耐药基因携带情况

    Table  4.   Drug resistance genes status of V. scophthalmi

    抗生素类型
    Types of antibiotics
    耐药基因
    Drug resistance genes
    携带耐药基因的分离株 (n=18)
    Isolates carrying resistance genes
    氨基糖苷类 Aminoglycosides aac (6')-Ⅰb, aac (6')-Ⅰb, aac (3')-Ⅰb 0 (0%)
    四环素类 Tetracyclines tetA, tetC, tetM 0 (0%)
    酰胺醇类 Amido alcohols floR Vs2, Vs3, Vs4, Vs7, Vs9, Vs11, Vs12, Vs15, Vs16, Vs17, Vs18 (61.11%)
    catA 0(0%)
    cmlA Vs1, Vs3, Vs4, Vs5, Vs6, Vs7, Vs8, Vs9, Vs12, Vs15, Vs16, Vs18 (66.67%)
    磺胺类 Sulfonamides sul1 0 (0%)
    sul2 Vs3, Vs4, Vs7, Vs9, Vs11, Vs12, Vs15, Vs16, Vs17, Vs18 (55.56%)
    sul3 0(0%)
    喹诺酮类 Quinolones qnrA Vs1, Vs2, Vs3, Vs5, Vs7, Vs8, Vs9, Vs14, Vs18 (50%)
    qnrB 0 (0%)
    qnrS Vs11 (5.56%)
    oqxAB 0 (0%)
    aac (6')-Ⅰb-cr 0 (0%)
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    表  5  大菱鲆弧菌分离株耐药基因与耐药表型符合率

    Table  5.   Coincidence rate of drug resistance genes and phenotype of V. scophthalmi strains

    抗生素类型
    Types of antibiotics
    耐药表型株数
    Number of isolates with
    drug resistance phenotype
    有耐药表型且携带耐药基因株数
    Number of strains with drug
    resistance phenotype and
    drug resistance genes
    符合率
    Coincidence rate/%
    氨基糖苷类 Aminoglycosides 0 0 100
    四环素类 Tetracyclines 0 0 100
    酰胺醇类 Amido alcohols 9 8 88.89
    磺胺类 Sulfonamides 6 3 50
    喹诺酮类 Quinolones 6 2 33.33
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    表  6  大菱鲆弧菌分离株耐药谱、耐药基因谱和ERIC基因型

    Table  6.   Drug resistance spectrum, resistance gene spectrum ERIC genotype of V. scophthalmi strains

    耐药谱
    Antibiotic resistance spectrum
    耐药基因谱
    Drug resistance genes spectrum
    ERIC基因型
    ERIC genotype
    Vs1 cmlA+qnrA
    Vs2 甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶钠 floR+qnrA
    Vs6 cmlA
    Vs7 磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲恶唑甲氧苄啶复合物 floR+cmlA+sul2+qnrA
    Vs10 甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星
    Vs13 磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲恶唑甲氧苄啶复合物
    Vs15 甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲恶唑甲氧苄啶复合物 floR+cmlA+sul2
    Vs18 甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星 floR+cmlA+sul2+qnrA
    Vs11 甲砜霉素、氟苯尼考 floR+cmlA+sul2+qnrS
    Vs3 磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲恶唑甲氧苄啶复合物 floR+cmlA+sul2+qnrA
    Vs4 floR+cmlA+sul2
    Vs5 磺胺间甲氧嘧啶钠 cmlA+qnrA
    Vs8 cmlA+qnrA
    Vs9 甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星 floR+cmlA+sul2+qnrA
    Vs14 qnrA
    Vs16 甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星 floR+cmlA+sul2
    Vs17 甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星 floR+sul2
    Vs12 甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星 floR+cmlA+sul2
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-05-09
  • 修回日期:  2021-06-10
  • 录用日期:  2021-07-21
  • 网络出版日期:  2021-08-13

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