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测定牡蛎糖原含量的微量反应体系的建立与优化

陈夕 吴彪 王岩 孙秀俊 周丽青 刘志鸿

陈夕, 吴彪, 王岩, 孙秀俊, 周丽青, 刘志鸿. 测定牡蛎糖原含量的微量反应体系的建立与优化[J]. 南方水产科学. doi: 10.12131/20210040
引用本文: 陈夕, 吴彪, 王岩, 孙秀俊, 周丽青, 刘志鸿. 测定牡蛎糖原含量的微量反应体系的建立与优化[J]. 南方水产科学. doi: 10.12131/20210040
Xi CHEN, Biao WU, Yan WANG, Xiujun SUN, Liqing ZHOU, Zhihong LIU. Establishment and optimization of micro-reaction system for determination of oyster glycogen content[J]. South China Fisheries Science. doi: 10.12131/20210040
Citation: Xi CHEN, Biao WU, Yan WANG, Xiujun SUN, Liqing ZHOU, Zhihong LIU. Establishment and optimization of micro-reaction system for determination of oyster glycogen content[J]. South China Fisheries Science. doi: 10.12131/20210040

测定牡蛎糖原含量的微量反应体系的建立与优化

doi: 10.12131/20210040
基金项目: 国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项 (2018YFD0900104);中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2021XT01);山东省重大科技创新工程项目 (2019JZZY020706)
详细信息
    作者简介:

    陈夕:陈 夕 (1993—),男,硕士研究生,研究方向为贝类遗传育种。E-mail: chenxi2647150@163.com

    通讯作者:

    刘志鸿 (1972—),女,博士,研究员,从事贝类遗传育种研究。E-mail: liuzh@ysfri.ac.cn

  • 中图分类号: S 912

Establishment and optimization of micro-reaction system for determination of oyster glycogen content

  • 摘要: 该研究以新鲜近江牡蛎 (Crassostrea ariakensis) 软体组织为实验材料,通过比较分析不同蒽酮硫酸比例、不同反应时间的吸光值确定最优反应条件,并对方法的最低检出限、重复性、稳定性和精确性进行评价,最终建立了牡蛎糖原含量的微量检测体系。建立的微量反应体系体积为300 μL,主要包括0.2%蒽酮硫酸溶液200 μL,样品待测液100 μL;沸水浴反应时间为10 min。该方法的葡萄糖最低检出限为0.001 5 mg·mL−1,标准曲线变异系数小于4%,证实该方法具有较高的检测灵敏度;显色反应完成后,室温条件下120 min内其吸光值基本不变,稳定性较高;测定牡蛎外套膜、鳃、唇瓣、性腺、肝胰腺、闭壳肌的加标回收率介于95.3%~105.8%,说明该法具有较高的准确性。因此,该研究建立的微量反应体系测定牡蛎糖原的方法具有试剂用量小、操作简单、单样品成本低等优势,同时重复性、稳定性、精确性均较高,适用于大批样品批量测定。该研究为快速、高效完成牡蛎样品糖原的检测提供了有效的技术方法。
  • 图  1  不同反应体系对吸光值的影响

    不同小写字母表示差异显著 (P<0.05),图2图5同此

    Figure  1.  Influence of different reaction systems at absorbance A620

    Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Figure 2 and Figure 5.

    图  2  吸光值随反应时间的变化曲线

    Figure  2.  Change curve of absorbance value with reaction time

    图  3  葡萄糖质量浓度与吸光值的标准曲线

    Figure  3.  Standard curve of glucose mass concentration and absorbance

    图  4  微量蒽酮比色法稳定性曲线

    Figure  4.  Stability curve of trace anthrone colorimetry

    图  5  不同方法测定牡蛎糖原质量分数

    Figure  5.  Determination of glycogen content in oyster tissues by different methods

    表  1  线性及重复性评价结果

    Table  1.   Linearity and repeatability evaluation results

    实验次数
    Experiment times
    葡萄糖标准品质量浓度 Glucose standard concentration/(mg·mL−1)R2
    00.012 50.0250.050.10.2
    1 0.106 0.218 0.308 0.494 0.853 1.530 0.999 2
    2 0.104 0.220 0.316 0.516 0.888 1.551 0.997 9
    3 0.104 0.210 0.310 0.505 0.843 1.526 0.999 0
    4 0.098 0.219 0.291 0.508 0.854 1.595 0.999 4
    5 0.106 0.218 0.308 0.494 0.853 1.530 0.999 5
    平均值 Average value 0.104 0.217 0.307 0.503 0.858 1.546
    标准偏差 Standard deviation 0.003 0.003 0.008 0.009 0.015 0.026
    变异系数 Coefficient of variation/% 3.005 1.549 2.760 1.706 1.795 1.674
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    表  2  牡蛎组织中糖原含量加标回收率实验结果

    Table  2.   Experimental results of recovery rate of glycogen content in oyster tissue

    组织
    Tissue
    原反应体系糖质量
    Sugar content of original reaction system/μg
    葡萄糖加入量
    Glucose addition/μg
    检出糖质量
    Detected sugar content/μg
    回收率
    Recovery rate/%
    闭壳肌 Adductor muscle 11.07 10.00 21.65 105.8
    鳃 Gill 35.47 30.00 64.07 95.3
    外套膜 Mantle 51.34 50.00 99.12 95.6
    肝胰腺 Hepatopancreas 26.20 30.00 56.95 102.5
    唇瓣 Lip 72.81 50.00 121.20 96.8
    性腺 Gonad 78.92 50.00 129.41 101.0
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    表  3  糖原含量的测定方法比较

    Table  3.   Comparison of determination methods of glycogen content

    测定方法
    Method
    基本原理
    Fundamental principle
    样品预处理
    Sample pretreatment
    样品成本
    Cost per sample/CNY
    参考来源
    Reference
    传统蒽酮比色法
    Traditional anthrone colorimetry
    糖原在酸的作用下水解为葡萄糖,葡萄糖与浓硫酸作用生成5-羟甲基糠醛,糠醛与蒽酮反应生成蓝绿色化合物[20-21]。此化合物在620 nm处有最大吸收峰。 在三氯乙酸中进行组织匀浆,乙醇提取糖原测定。或使用浓碱消化后,乙醇提取糖原测定 0.8~1.2 Carroll等[17]
    试剂盒法
    Kit method
    同传统蒽酮比色法 浓碱消化后定容,去除糖原以外的其他成分,离心稀释后测定 5.0~7.0 肝/肌糖原测定试剂盒说明书 (南京建成)
    同传统蒽酮比色法 同南京建成试剂盒 7.0~9.0 糖原含量检测试剂盒说明书 (Solarbio)
    糖原酶促分解为葡萄糖,葡萄糖与显色剂反应,产物在570 nm处有最大吸收峰。 组织使用匀浆仪充分匀浆,定容后取上清液蒸馏水高倍稀释后直接测定 37.0~42.0 EnzyChrom™ Glycogen Assay Kit (BioAssay Systems)
    近红外 (NIR) 光谱分析
    Near infrared spectroscopy
    根据含氢基团X-H (X=C、N、O) 振动的倍频和合频吸收计算糖原含量。 根据传统的糖原检测方法测定糖原,构建模型  − Wang等[19]
    微量蒽酮比色法
    Trace anthrone colorimetry
    同传统蒽酮比色法 同南京建成试剂盒 0.2~0.4     −
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-01-19
  • 修回日期:  2021-04-28
  • 录用日期:  2021-05-08
  • 网络出版日期:  2021-05-14

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