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溶藻弧菌ZJ-T小RNA srvg17985缺失突变株的构建及该小RNA功能的初步分析

邓益琴 陈偿 苏友禄 程长洪 马红玲 郭志勋 冯娟

邓益琴, 陈偿, 苏友禄, 程长洪, 马红玲, 郭志勋, 冯娟. 溶藻弧菌ZJ-T小RNA srvg17985缺失突变株的构建及该小RNA功能的初步分析[J]. 南方水产科学, 2019, 15(1): 42-53. doi: 10.12131/20180127
引用本文: 邓益琴, 陈偿, 苏友禄, 程长洪, 马红玲, 郭志勋, 冯娟. 溶藻弧菌ZJ-T小RNA srvg17985缺失突变株的构建及该小RNA功能的初步分析[J]. 南方水产科学, 2019, 15(1): 42-53. doi: 10.12131/20180127
Yiqin DENG, Chang CHEN, Youlu SU, Changhong CEHNG, Hongling MA, Zhixun GUO, Juan FENG. Construction of knock-out mutant of sRNA srvg17985 in Vibrio alginolyticus ZJ-T and its preliminary function analysis[J]. South China Fisheries Science, 2019, 15(1): 42-53. doi: 10.12131/20180127
Citation: Yiqin DENG, Chang CHEN, Youlu SU, Changhong CEHNG, Hongling MA, Zhixun GUO, Juan FENG. Construction of knock-out mutant of sRNA srvg17985 in Vibrio alginolyticus ZJ-T and its preliminary function analysis[J]. South China Fisheries Science, 2019, 15(1): 42-53. doi: 10.12131/20180127

溶藻弧菌ZJ-T小RNA srvg17985缺失突变株的构建及该小RNA功能的初步分析

doi: 10.12131/20180127
基金项目: 中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2017YB27,2017YB01);联合资助开放课题基金 (2018011004);中国水产科学研究院基本科研业务费专项资金 (2017HY-ZD1007);广东省“扬帆计划”引进创新团队 (2016YT03H038);国家自然科学基金项目 (31502210)
详细信息
    作者简介:

    邓益琴(1990—),女,博士,助理研究员,从事鱼类细菌病及防治技术研究。E-mail: yiqindd@126.com

    通讯作者:

    冯 娟(1973 — ),女,博士,研究员,从事鱼类细菌病及防治技术研究。E-mail: jannyfeng@163.com

  • 中图分类号: Q 933

Construction of knock-out mutant of sRNA srvg17985 in Vibrio alginolyticus ZJ-T and its preliminary function analysis

  • 摘要: 利用同源重组技术构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) ZJ-T小RNA srvg17985的缺失突变株,并比较研究了野生株和srvg17985突变株在LBS中的生长特性、运动性、胞外蛋白酶分泌、对铁的吸收利用、对抗生素的抗性以及生长代谢等生物学特性。结果表明,小RNA srvg17985缺失后不影响溶藻弧菌在LBS中的生长、运动性、胞外蛋白酶分泌、对铁的吸收利用、对抗生素的抗性以及对测定的多数碳源、氮源的代谢;但srvg17985突变株对昆布多糖(laminarin)、果胶(pectin)以及二羟基丙酮(dihydroxyacetone)的利用增强,并转变为可利用丙氨酸-天冬氨酸(Ala-Asp)作为单一氮源。
  • 图  1  srvg17985的序列信息

    下划线部分为srvg17985的序列,深灰色背景部分依次为上下游同源臂扩增的引物对

    Figure  1.  Sequence information of srvg17985

    The underlined is the sequence of srvg17985 and the dark gray background indicates the primer pairs for the amplification of two flanking fragments.

    图  2  重组自杀质粒构建和突变株筛选

    A1. 上游;A2. 下游

    Figure  2.  Construction of recombinant suicide vector and screening of mutant strain

    A1. up stream;A2. down stream

    图  3  pSW7848 PCR线性化片段 (A)、srvg17985上下游同源臂片段 (B)、重组自杀质粒的PCR鉴定扩增片段 (C) 以及srvg17985缺失株的PCR鉴定 (D)

    泳道M1. DNA Marker DL10 000;泳道1. pSW7848线性化片段;泳道M2. DNA Marker DL2 000;泳道2/3. srvg17985上/下游片段;泳道M3. DNA Marker DL10 000;泳道4. 重组子pSW7848-srvg17985检测片段;泳道M4. DNA Marker DL2 000;泳道5. 野生株ZJ-T;泳道6. srvg17985候选突变株

    Figure  3.  Linearized segment of pSW7848 (A), upstream and downstream homologous segments of srvg17985 (B), segment of identification of recombinant suicide vector by PCR (C) and identification of srvg17985 deletion mutant by PCR (D)

    Lane M1. DNA Marker DL10 000; Lane 1. linearized segment of pSW7848; Lane M2. DNA Marker DL2 000; Lane 2/3. UP/DOWN segments of srvg17985; Lane M3. DNA Marker DL10 000; Lane 4. segment of identification of the recombinant suicide vector by PCR; Lane M4. DNA Marker DL2 000; Lane 5. wild type ZJ-T; Lane 6. deletion candidate of srvg17985

    图  4  溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS培养基中的生长曲线

    误差线对应于标准偏差

    Figure  4.  Growth curves of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 in LBS medium

    Error bars correspond with standard deviations.

    图  5  溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在0.3%和1.5%琼脂LBS平板上的运动性 (A) 和统计分析 (B)

    Figure  5.  Motility of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 on 0.3% and 1.5% LBS agar plates (A) and statistical analysis (B)

    图  6  溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS+1%脱脂奶粉平板上胞外蛋白酶的分泌 (A) 和统计分析 (B)

    图A内箭头指向菌斑边缘,外箭头指向蛋白酶分泌圈边缘

    Figure  6.  Extracellular protease activities of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 mutant on LBS agar plates containing 1% skimmed milk (A) and statistical analysis (B)

    The inner arrow points to the edge of the plaque, and the outer arrow points to the edge of the proteolytic ring in Fig. A.

    图  7  溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS以及LBS添加120 μmol·L–1 DIP平板上的生长情况

    Figure  7.  Growth ability of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 on LBS plate and LBS plate supplemented with 120 μmol·L–1 DIP

    图  8  srvg17985缺失对昆布多糖、果胶、二羟基丙酮以及丙氨酸-天冬氨酸代谢的影响

    误差线对应于标准偏差

    Figure  8.  Effect of srvg17985 deletion on metabolism of laminarin, pectin, dihydroxyacetoneor Ala-Asp

    Error bars correspond with standard deviations.

    表  1  本研究所用菌株和质粒

    Table  1.   Strains and plasmids used in this study

    菌株、质粒
    strain, plasmid
    相关特征
    relevant characteristics
    来源
    source
    菌株 strains
    V. alginolyticus ZJ-T 氨苄青霉素抗性,野生菌株ZJ-51的半透明/平滑变体;
    从中国南部沿海的患病石斑鱼中分离
    参考文献[13]
    ZJ-T-Δsrvg17985 氨苄青霉素抗性;ZJ-T中缺失srvg17985 本研究
    Escherichia coli Π3813 laclQ,thi1,supE44,endA1,recA1,hsdR17,gyrA462,zei298::Tn10[Tc],ΔthyA::erm-pir116; 自杀质粒pSW7848的中间宿主 参考文献[14]
    E. coli GEB883 大肠杆菌野生株K12 ΔdapA::ermpir RP4-2 ΔrecAgyrA462,zei298::Tn10;接合作用供体菌 参考文献[15]
    质粒 plasmids
    pSW7848 氯霉素抗性;自杀质粒,R6K起点,复制需要Pir蛋白,
    具有ccdB毒性基因
    参考文献[16]
    pSW7848-Δsrvg17985 氯霉素抗性;pSW7848含有待缺失srvg17985的上下游同源臂 本研究
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    表  2  本研究所用引物

    Table  2.   Primers used in this study

    引物
    primer
    序列 (5'–3')
    sequence
    pSW7848-F GTCTGATTCGTTACCAATTATGACAAC
    pSW7848-R GAATTCGATATCAAGCTTATCGATAC
    srvg17985-UP-F aagcttgatatcgaattcCGCCAAACACGCCAAACA
    srvg17985-UP-R acctcgttATTTAAAGCATGGTTCATTTTTCTCAAAAAAC
    srvg17985-DOWN-F tgctttaaatAACGAGGTAGAGGCGCAC
    srvg17985-DOWN-R ttggtaacgaatcagacGCAAATCAAATTGCAATGCGC
    Del-check-pSW7848-F TCACTGTCCCTTATTCGCACC
    Del-check-pSW7848-R CTGCTTTTGAGCACTACCCG
    Δsrvg17985-check-F CAATTCTCTCGCGTTTGGTC
    Δsrvg17985-check-R CATTGCTGACAACGTGTCTTG
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    表  3  PM02板测试组分

    Table  3.   Test components of PM02 plate


    well (PM02)
    A B C D E F G H
    1 空白 N-乙酰基-D-半乳糖胺 龙胆 D-棉子糖 癸酸 D-乳酸甲酯 乙酰胺 L-鸟氨酸
    2 硫酸软骨素C N-乙酰-神经氨酸 L-葡萄糖 水杨甙 己酸 丙二酸 L-丙氨酰胺 L-苯丙氨酸
    3 α-环糊精 β-D-阿洛糖 D-乳糖醇 景天庚酮糖酐 柠康酸 6-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-
    D-葡糖-己酸
    N-乙酰-L-谷氨酸 L-焦谷氨酸
    4 β-环糊精 苦杏仁甙 D-松三糖 L-山梨糖 D, L-柠康酸 草酸 L-精氨酸 L-缬氨酸
    5 γ-环糊精 D-阿拉伯糖 麦芽糖醇 水苏糖 D-氨基葡萄糖 草酰苹果酸 甘氨酸 D, L-肉碱
    6 糊精 D-阿拉伯糖醇 a-甲基-D-葡萄糖苷 D-塔格糖 2-羟基苯甲酸 奎尼酸 L-组氨酸 仲丁胺
    7 明胶 L-阿拉伯糖醇 β-甲基-D-半乳糖苷 松二糖 4-羟基苯甲酸 D-核糖酸-1, 4-内酯 L-高丝氨酸 D, L-章鱼胺
    8 糖原 熊果苷 3-甲基葡萄糖 木糖醇 β-羟基丁酸 癸二酸 羟基-L-脯氨酸 腐胺
    9 菊粉 2-脱氧-D-核糖 β-甲基-D-葡萄糖醛酸 N-乙酰基-D-葡糖胺醇 γ-羟基丁酸 山梨酸 L-异亮氨酸 二羟基丙酮
    10 昆布多糖 i-赤藓糖醇 α-甲基-D-甘露糖苷 γ-氨基-N-丁酸 α-酮基-戊酸 琥珀酸 L-亮氨酸 2, 3-丁二醇
    11 甘露聚糖 D-岩藻糖 β-甲基-D-木糖苷 δ-氨基戊酸 衣康酸 D-酒石酸 L-赖氨酸 2, 3-丁酮
    12 果胶 3-0-β-D-吡喃半乳糖基-
    D-阿拉伯糖
    帕拉金糖 丁酸 5-酮基-D-葡萄糖酸 L-酒石酸 L-蛋氨酸 3-羟基2-丁酮
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    表  4  PM08板测试组分

    Table  4.   The test components of PM08 plate


    well (PM08)
    A B C D E F G H
    1 空白 甘氨酸-天冬氨酸 赖氨酸-甘氨酸 脯氨酸-谷氨酸 苏氨酸-苯丙氨酸 缬氨酸-丝氨酸 γ-谷氨酸-甘氨酸 甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸
    2 L-谷氨酰胺 甘氨酸-异亮氨酸 赖氨酸-甲硫氨酸 脯氨酸-异亮氨酸 苏氨酸-丝氨酸 β-丙氨酸-丙氨酸 γ-D-谷氨酸-甘氨酸 甘氨酸-甘氨酸-D-亮氨酸
    3 丙氨酸-天冬氨酸 组氨酸-丙氨酸 甲硫氨酸-酸苏氨酸 脯氨酸-赖氨酸 色氨酸-缬氨酸 β-丙氨酸-甘氨酸 甘氨酸-D-丙氨酸 甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸
    4 丙氨酸-谷氨酰胺 组氨酸-谷氨酸 甲硫氨酸-酪氨酸 脯氨酸-丝氨酸 酪氨酸-异亮氨酸 β-丙氨酸-组氨酸 甘氨酸-D-天冬氨酸 甘氨酸-甘氨酸-异亮氨酸
    5 丙氨酸-异亮氨酸 组氨酸-组氨酸 苯丙氨酸-天冬氨酸 脯氨酸-色氨酸 酪氨酸-缬氨酸 甲硫氨酸-β-丙氨酸 甘氨酸-D-丝氨酸 甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸
    6 丙氨酸-甲硫氨酸 异亮氨酸-天冬酰胺 苯丙氨酸-谷氨酸 脯氨酸-缬氨酸 缬氨酸-丙氨酸 β-丙氨酸-苯丙氨酸 甘氨酸-D-苏氨酸 甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸
    7 丙氨酸-缬氨酸 异亮氨酸-亮氨酸 谷氨酰胺-谷氨酸 丝氨酸-天冬酰胺 缬氨酸-谷氨酰胺 D-丙氨酸-D-丙氨酸 甘氨酸-D-缬氨酸 缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸
    8 天冬氨酸-丙氨酸 亮氨酸-天冬酰胺 苯丙氨酸-甲硫氨酸 丝氨酸-天冬氨酸 缬氨酸-谷氨酸 D-丙氨酸-甘氨酸 亮氨酸-β-丙氨酸 甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸
    9 天冬氨酸-谷氨酰胺 亮氨酸-组氨酸 苯丙氨酸-酪氨酸 丝氨酸-谷氨酰胺 缬氨酸-赖氨酸 D-丙氨酸-亮氨酸 亮氨酸-D-亮氨酸 亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸
    10 天冬氨酸-甘氨酸 亮氨酸-脯氨酸 苯丙氨酸-缬氨酸 丝氨酸-谷氨酸 缬氨酸-甲硫氨酸 D-亮氨酸-D-亮氨酸 苯丙氨酸-β-丙氨酸 亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸
    11 谷氨酸-丙氨酸 亮氨酸-酪氨酸 脯氨酸-精氨酸 苏氨酸-天冬氨酸 缬氨酸-苯丙氨酸 D-亮氨酸-甘氨酸 丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸 苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸
    12 甘氨酸-天冬酰胺 赖氨酸-天冬氨酸 脯氨酸-天冬酰胺 苏氨酸-谷氨酰胺 缬氨酸-脯氨酸 D-亮氨酸-酪氨酸 D-丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸 酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸
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    表  5  溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985对各抗生素抗性

    Table  5.   Antibiotics resistance of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985

    抗生素
    antibiotic
    浓度/μg·片−1
    concentration
    抑菌圈直径/mm size of inhibition zone
    ZJ-T ZJ-T-Δsrvg17985
    林可霉素 lincomycin 2 0.00/R 0.00/R
    万古霉素 vancomycin 30 0.00/R 0.00/R
    克林霉素 clindamycin 2 0.00/R 0.00/R
    氯霉素 chloramphenicol 300 21.00±1.41/S 20.00±0.00/S
    氨苄青霉素 ampicillin 10 0.00/R 0.00/R
    苯唑西林 oxacillin 1 0.00/R 0.00/R
    哌拉西林 piperacillin 100 0.00/R 0.00/R
    卡那霉素 kanamycin 30 0.00/R 0.00/R
    青霉素-G penicillin-G 10 0.00/R 0.00/R
    头孢唑啉 cefazolin 30 11.00±1.41/R 11.00±1.41/R
    妥布霉素 tobramycin 10 12.50±0.71/I 12.67±2.31/I
    新霉素 neomycin 30 13.67±2.52/I 15.00±2.65/I
    新生霉素 novobiocin 30 21.00±5.66/S 20.50±4.95/S
    四环素 tetracycline 30 15.67±6.03/I 16.33±3.06/I
    红霉素 erythromycin 15 12.00±2.65/R 14.00±1.41/I
    麦迪霉素 medemycin 30 11.50±0.71/R 12.50±3.54/R
    多粘菌素B polymyxin B 300 12.33±2.31/S 14.00±2.83/S
    多西环素 doxycycline 30 19.50±3.54/S 20.00±2.83/S
    乙酰螺旋霉素 acetylspiramycin 30 0.00/R 0.00/R
    大观霉素 spectinomycin 100 10.33±1.53/R 11.00±1.41/R
    米诺霉素 minocycline 30 24.00±5.66/S 25.50±4.95/S
    头孢克肟 cefixime 5 10.67±1.53/R 12.00±4.24/R
    阿莫西林 amoxicillin 10 0.00/R 0.00/R
    阿奇霉素 azithromycin 15 0.00/R 0.00/R
    克拉霉素 clarithromycin 15 12.33±0.58/R 11.00±1.73/R
    罗红霉素 roxithromycin 15 11.00±1.41/R 10.67±0.58/R
    替考拉宁 teicoplanin 30 0.00/R 0.00/R
    磷霉素 fosfomycin 200 17.33±2.31/S 18.00±1.41/S
    链霉素 streptomycin 300 11.33±1.53/S 11.00±1.41/S
    庆大霉素 gentamicin 120 18.00±4.36/S 17.00±1.73/S
     注:S. 敏感;I. 中介;R. 耐药  Note: S. susceptible; I. intermediate; R. resistance to drug
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-06-12
  • 修回日期:  2018-08-02
  • 网络出版日期:  2018-12-05
  • 刊出日期:  2019-02-05

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