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基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立
马艳平, 郝乐, 梁志凌, 马江耀, 李盈, 柯浩, 刘振兴, 曹俊明
2018, 14(3): 113-119. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.03.014
鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将pORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短 ORF65 (truncated ORF65) 插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-trunORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、BepiPred 1.0软件预测了pORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-modORF65。重组质粒分别转入BL21 (DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,pET32a-modORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 kD。此外,利用rProtein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清IgM,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的pORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测pEGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。
关键词: 鲤疱疹病毒3型, ORF65, B细胞表位融合表达, rProtein G亲和层析, ELISA, 抗体特异性检测
基于鲤疱疹病毒3型ORF65基因的DNA疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护研究
李盈, 刘振兴, 马艳平, 曹俊明, 马江耀, 郝乐, 梁志凌, 柯浩, 李玉谷
2019, 15(4): 122-126. doi: 10.12131/20190033
为开发针对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3) [ 又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)] 的DNA疫苗,该研究将CyHV-3 ORF65插入pEGFP-N1,构建pEGFP-ORF65重组质粒,通过转染实验与活体成像实验证实pORF65-EGFP融合蛋白可以在建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)体外、体内表达;重组质粒按照3 μg·尾−1的剂量尾柄肌肉注射免疫10 g左右的建鲤鱼苗,免疫3次,ELISA检测表明pEGFP-ORF65免疫后可以显著提高血清特异性抗体水平;攻毒实验显示,CyHV-3攻毒21 d后,PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF65组的建鲤成活率分别为25%、30%和90%,攻毒建鲤的成活率显著提高(P<0.01)。该研究为ORF65作为DNA疫苗靶基因应用于CyHV-3的防控提供了依据。
关键词: 鲤疱疹病毒3型, 锦鲤疱疹病毒, ORF65, DNA疫苗, ELISA
β-1,3-葡聚糖对低盐度凡纳滨对虾血液代谢物和免疫的影响
赵红霞, 胡俊茹, 黄燕华, 陈冰, 曹俊明
doi: 10.12131/20200046
为研究长期投喂β-1,3-葡聚糖对低盐度 (5) 养殖凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 血液代谢物和肌肉免疫相关酶活性的影响,以初始体质量为 (0.65±0.01) g的凡纳滨对虾为研究对象,分别投喂添加0、250、500和1 000 mg·kg−1 β-1,3-葡聚糖的4种等氮等脂试验饲料,试验期84 d。结果显示,凡纳滨对虾血清乳酸盐和肌肉溶菌酶活性最高值出现在摄食后的第14天,总蛋白、甘油三酯、胆固醇、葡萄糖含量最高值出现在第42天,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗超氧阴离子水平的最高值出现在第56天。与对照组相比,饲料中添加250 mg·kg−1 β-1,3-葡聚糖显著提高了凡纳滨对虾血清甘油三酯、胆固醇、葡萄糖、乳酸盐含量和超氧化物歧化酶活性 (P<0.05);500 mg·kg−1 β-1,3-葡聚糖显著提高了其血清总蛋白、抗超氧阴离子水平 (P<0.05),250或500 mg·kg−1 β-1,3-葡聚糖可显著增强过氧化氢酶、溶菌酶活性 (P<0.05)。饲料中添加250或500 mg·kg−1 β-1,3-葡聚糖14、42或56 d,可显著提高低盐度养殖凡纳滨对虾营养物质代谢和非特异性免疫功能。
关键词: 凡纳滨对虾, β-1,3-葡聚糖, 血液代谢物, 免疫相关酶