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多壁碳纳米管固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定织纹螺中河豚毒素

孙博伦 王旭峰 李来好 赵东豪 王强 黎智广 蔡楠 关婉琪

引用本文:
Citation:

多壁碳纳米管固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定织纹螺中河豚毒素

    作者简介: 孙博伦(1992 — ),男,硕士研究生,从事食品质量安全研究。E-mail: bolun001@163.com;
    通讯作者: 李来好, laihaoli@163.com
  • 中图分类号: TS 254.7

Determination of tetrodotoxin in Nassarius by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with multi-walled carbon nanotubes purification

    Corresponding author: Laihao LI, laihaoli@163.com ;
  • CLC number: TS 254.7

  • 摘要: 建立了多壁碳纳米管(MWCNTs)固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定织纹螺中河豚毒素(TTX)的方法,样品用1%乙酸甲醇溶液提取,调节pH至8.5~9.0后,采用碳纳米管净化处理后上机测定。以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相,经Amide柱梯度洗脱,以电喷雾离子源正离子模式,多反应监测(MRM)测定,外标法定量。在0.3~50 ng·mL–1质量浓度范围内,相关系数(R)大于0.999,加标回收率为83.7%~91.4%,相对标准偏差为2.3%~8.6%,检测限和定量限分别为0.3 μg·kg–1和1 μg·kg–1。该方法适用于织纹螺中TTX的检测。
  • 图 1  不同上样液的pH对回收率的影响

    Figure 1.  Influence of pH on recovery of tetrodotoxin in sample solution

    图 2  空白样品和10 μg·kg–1加标阴性样品经碳纳米管净化后的MRM图谱

    Figure 2.  MRM chromatograms of 10 μg·kg–1 spiked sample cleaned up by carbon nanotubes

    表 1  梯度洗脱条件

    Table 1.  Gradient elution condition

    t/min 流动相A/%
    mobile phase A
    流动相B/%
    mobile phase B
    0 95 5
    1.0 40 60
    3.0 40 60
    3.2 95 5
    5.0 95 5
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    表 2  TTX的多反应监测条件

    Table 2.  Conditions of multiple reaction monitoring for tetrodotoxin

    分析物
    analyte
    母离子/(m/z)
    parent ion
    子离子/(m/z)
    daughter ion
    锥孔电压/V
    cone voltage
    碰撞能量/eV
    collision energy
    TTX 320.1 161.9 35 35
    302.0* 35 20
     注:*. 定量离子  Note: *. quantitative ion
    下载: 导出CSV

    表 3  样品加标回收率与相对标准偏差

    Table 3.  Recovery of standard addition and relative standard deviation for tetrodotoxin

    添加水平/μg·kg–1
    added amount
    回收率/%
    recovery
    相对标准偏差/%
    RSD
    1 91.4 2.3
    10 83.7 3.4
    100 84.8 8.6
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-03-29
  • 录用日期:  2018-04-21
  • 刊出日期:  2018-10-01

多壁碳纳米管固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定织纹螺中河豚毒素

    作者简介:孙博伦(1992 — ),男,硕士研究生,从事食品质量安全研究。E-mail: bolun001@163.com
    通讯作者: 李来好, laihaoli@163.com
  • 1. 浙江海洋大学食品与医药学院,浙江 舟山 316022
  • 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所,农业农村部水产品加工重点实验室,广东省渔业生态环境重点开放实验室,广东 广州 510300

摘要: 建立了多壁碳纳米管(MWCNTs)固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定织纹螺中河豚毒素(TTX)的方法,样品用1%乙酸甲醇溶液提取,调节pH至8.5~9.0后,采用碳纳米管净化处理后上机测定。以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相,经Amide柱梯度洗脱,以电喷雾离子源正离子模式,多反应监测(MRM)测定,外标法定量。在0.3~50 ng·mL–1质量浓度范围内,相关系数(R)大于0.999,加标回收率为83.7%~91.4%,相对标准偏差为2.3%~8.6%,检测限和定量限分别为0.3 μg·kg–1和1 μg·kg–1。该方法适用于织纹螺中TTX的检测。

English Abstract

  • 河豚毒素(TTX)为氨基全氢喹唑啉化合物,是一种典型的非蛋白类神经毒素,能造成神经麻痹,严重患者会因为中枢神经麻痹导致呼吸停止而死亡[1-2]。TTX的毒性是氰化物的1 250多倍[3],最初在河鲀体内发现,后陆续发现产TTX的细菌[4-5],在织纹螺(Nassarius)等多种动物体内也检出TTX[6-8]。织纹螺为腐食性生物,可通过食物链富集TTX,近年来,在中国台湾[9]、福建[10]、江苏[11]等沿海地区发生多起因食用织纹螺引起的中毒事件,导致多人死亡,引起了相关部门的高度关注,通过从织纹螺体内分离出产TTX菌株确认TTX为其主要毒素[12]。由于织纹螺中常含有较高浓度的TTX,中毒后没有特效解毒剂,因此需要建立织纹螺中TTX的检测方法,对螺类生物的TTX含量进行监控,减少食物中毒事件的发生。

    TTX生物检测存在一定的局限性,其检测结果不稳定,重复性较差。免疫检测法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)[13]和免疫层析法(ICA)[14]2种,在食品和农产品残留检测中较为常用[15]。目前液相色谱-质谱联用检测法(LC-MS/MS)是检测的热点[16-17],其灵敏度和准确性都要优于其他方法,但其对检测样品的纯化要求高。样品本底基质复杂,如果样品净化不理想,在上机检测过程易受基质干扰,会出现灵敏度低和回收率低等问题。严忠雍等[18]和Guo等[19]都采用免疫亲和柱对样品进行净化,显著降低了基质效应,后用LC-MS/MS检测,前者的定量限为0.3 μg·kg–1,回收率达到88.7%~102.3%;后者的定量限为1 μg·kg–1,回收率为75.8%~107%。虽然免疫亲和柱特异性强,作为前处理净化方法效果良好,但是价格昂贵,检测成本高[20]

    传统的TTX样品前处理方法较少,且净化效果一般,存在基质干扰严重和假阳性等问题,会对检测结果造成影响。功能性纳米材料能够弥补该不足,其高效、经济的优点让其成为食品检测领域的热点,并已经取得一定研究进展。碳纳米管具有特殊物理结构和化学性质,其表面积大,吸附力强,性质稳定,在检测领域有广泛前景[21]。Taghizadeh等[22]利用纳米管复合材料萃取鱼类、沉积物、土壤和水样中的重金属离子,对3种重金属离子的检测限分别达到了0.09 ng·mL–1、0.72 ng·mL–1和1.0 ng·mL–1,该方法适用于样品中微量重金属离子的萃取;Wang等[23]利用多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)萃取水样和牛奶样品中的多溴联苯醚,用气相色谱进行分析,检测限为3.6~8.6 ng·L–1,回收率为90%~119%,多壁碳纳米管对多溴联苯醚的吸附效率高;陈啟荣等[24]以乙腈提取茶叶样品中的26种农药成分,用多壁碳纳米管进行净化和富集,用气相色谱进行分析,采用外标法定量,检出限为0.005~0.05 mg·kg–1,定量限为0.015~0.15 mg·kg–1,回收率为66.6%~125.5%,与其他用于检测分析茶叶中残留农药的方法相比,该方法简单方便且回收率和准确性较高。同时,市面上还有多个有关多壁碳纳米管对样品进行检测分析的专利,通过多壁碳纳米管进行吸附,经过洗脱、浓缩,对组分进行定量分析;廖且根等[25]建立了多壁碳纳米管检测水样中的微囊藻毒素含量方法;陈黎等[26]建立了多壁碳纳米管检测烟草中残留农药的方法。这些专利方法均利用多壁碳纳米管材料吸附能力强的特点,且具有用量少、检测成本低等优点。

    本研究建立了碳纳米管固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定织纹螺中河豚毒素的方法,样品经过碳纳米管富集与净化后,经LC-MS/MS测定,用外标法定量。本方法前处理过程简单,结果灵敏度高、准确性好,适用于织纹螺中TTX的残留检测。

    • Acquity UPLC I-Class/Xevo TQS超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪(美国Waters公司);5810型台式离心机(德国Eppendorf公司);MS3旋涡混合器(德国IKA公司);Milli Q去离子水发生器(美国Millipore公司);N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司);PHS-25 pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

    • 实验材料为氨水(分析纯,广州化学试剂厂)、乙腈、甲醇(均为色谱纯或分析纯,美国Sigma公司),TTX标准品纯度≥99.0% (美国Sigma公司),羧基化碳纳米管CNT303 50 μm (北京德科岛科技有限公司),羟基化碳纳米管CNT203 10~30 μm (北京德科岛科技有限公司),河豚毒素免疫亲和柱3 mL(江苏美正生物科技有限公司)。织纹螺采自广东湛江。

      试剂配制:1%乙酸,1%乙酸甲醇,0.1%氨水,0.1%甲酸-乙腈(1∶1,V/V )。流动相为0.1%甲酸水;TTX标准贮备溶液(100 μg·mL–1)为取TTX冻干标准品1.00 mg,加入0.1%甲酸-乙腈(1∶1,V/V )定容至10 mL,于4 ℃保存;碳纳米管洗脱液为0.1%乙酸-乙腈(8∶2,V/V );标准工作液为取TTX标准储备液,用0.1%甲酸-乙腈(1∶1,V/V )逐级稀释成质量浓度分别为0.5 ng·mL–1、1 ng·mL–1、5 ng·mL–1、10 ng·mL–1和50 ng·mL–1的梯度标准工作液。

    • 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温40 ℃;进样量为5 μL;流速为0.3 mL·min–1;流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水(B)。梯度洗脱条件见表1

      t/min 流动相A/%
      mobile phase A
      流动相B/%
      mobile phase B
      0 95 5
      1.0 40 60
      3.0 40 60
      3.2 95 5
      5.0 95 5

      表 1  梯度洗脱条件

      Table 1.  Gradient elution condition

    • 电喷雾离子源,正离子扫描;检测方式为多反应监测( MRM );毛细管电压为3.0 kV;离子源温度150 ℃;脱溶剂气温度400 ℃;锥孔气流量为150 L·h–1;脱溶剂气流量为900 L·h–1;TTX的MRM离子对见表2

      分析物
      analyte
      母离子/(m/z)
      parent ion
      子离子/(m/z)
      daughter ion
      锥孔电压/V
      cone voltage
      碰撞能量/eV
      collision energy
      TTX 320.1 161.9 35 35
      302.0* 35 20
       注:*. 定量离子  Note: *. quantitative ion

      表 2  TTX的多反应监测条件

      Table 2.  Conditions of multiple reaction monitoring for tetrodotoxin

    • 用自来水清洗织纹螺2~3遍,洗去表面泥沙。用钳子夹碎织纹螺外壳,取织纹螺全部组织充分均质备用。取织纹螺肉匀浆样品2.00 g于50 mL离心管中,加入5 mL 1%乙酸甲醇溶液,在60 ℃水浴中超声15 min,待其冷却至室温,在6 000 r·min–1下离心5 min,转移上清液,在残渣中加入5 mL 1%乙酸甲醇,重复提取1次,合并上清液。取5 mL上清液,在样液中逐滴加入氨水并充分搅拌,调节pH至8.5,过碳纳米管小柱净化。

    • 取250 mg羧基化多壁碳纳米管,湿法装填于空的6 mL小柱中,依次加入5 mL 0.1%乙酸-乙腈(8∶2,V/V )、5 mL 0.1%氨水活化和平衡小柱,挤干柱中残留液体,将5 mL提取液全部上样,挤干柱中液体后用5 mL甲醇、5 mL纯水依次淋洗,挤干小柱,用3 mL 0.1%乙酸-乙腈(8∶2,V/V )洗脱。收集3 mL洗脱液,涡旋后过0.22 μm滤膜,供LC-MS/MS分析。

    • 取出冷藏保存的免疫亲和柱,自然恢复至室温,取下柱头,放出柱内保存的PBS溶液。将5 mL提取液全部上样,用10 mL超纯水淋洗,挤干小柱后用5 mL 2%乙酸甲醇溶液洗脱,洗脱液于45 ℃下氮吹至干,残渣用1 mL 0.1%甲酸-乙腈(1∶1,V/V )复溶,过0.22 μm滤膜,供LC-MS/MS分析(参照GB 5009.206—2016)。

    • 织纹螺样品中蛋白质、色素和脂肪等杂质多,TTX不溶于有机试剂,易溶于酸性水溶液或酸性醇溶液,因此需要选取适当的萃取溶剂提取样品中的TTX。分别用1%乙酸水溶液和1%乙酸甲醇溶液提取样品中的TTX,回收率相近,均能有效提取TTX。用乙酸水溶液提取织纹螺肉时会提取出部分蛋白质成分,对仪器检测造成干扰。乙酸甲醇溶液提取能力强,能有效穿透组织,使蛋白质发生沉降,可降低上机检测时蛋白质对仪器产生的累积性干扰效应。在用乙酸甲醇溶液提取样品后,可用二氯甲烷除去脂肪和蛋白质。而吴佳俊等[27]认为用二氯甲烷处理并没有降低基质效应,也不能提高回收率。由于织纹螺样品蛋白质和脂肪含量低,因此本实验在用1%乙酸甲醇提取后,经高速离心吸取上清液过柱,上清液澄清,上样过程速率适当,没有出现堵柱情况。

    • 碳纳米管吸附力强,对样品的净化效果好[22-23]。本实验比较了2种碳纳米管对样液中TTX的吸附和净化能力,发现羟基化碳纳米管在上样和淋洗阶段不能很好保留样品中的TTX,均有不同程度的丢失,造成回收率下降;羧基化碳纳米管在上样、淋洗阶段能很好保留TTX,洗脱后其回收率达到85%~90%。在选择装填小柱规格时,若选用3 mL空小柱装填,装填后碳纳米管间会出现空隙使得吸附效果减弱,因此选用6 mL的小柱进行湿法装填。

    • TTX与碳纳米管的结合作用力与样液的pH有关,在酸性或中性条件下结合能力较弱,需要在碱性条件下上样。本实验用氨水调节样液的pH,通过比较不同pH下加标样品的回收率,优化上样液的pH (图1)。上样液pH 为8.5~9.0时,其吸附能力最强,pH≥9.0时TTX不稳定,易分解,回收率下降,因此确定上样液的pH为8.5~9.0。

      图  1  不同上样液的pH对回收率的影响

      Figure 1.  Influence of pH on recovery of tetrodotoxin in sample solution

    • 与WCX柱和MCX柱相比,多壁碳纳米管小柱对生物样品中TTX的承载量更大,净化效果更好。之前的研究[28-29]用WCX小柱净化河鲀鱼肉样品时,加标回收率为75%~86%,但实际上样量仅为1 mL,在之后的淋洗过程中,甲醇和氨水均会造成样品中TTX的损失。黄清发等[30]用2%乙酸甲醇提取TTX,样液经过KOH碱解处理,最终上样液只有0.3 mL,之后过MCX柱,用BSTFA衍生,采用气相色谱进行分析。使用MCX柱与WCX柱净化样品时,均存在上样量偏少的问题,而加大实际样品的上样量又会造成上样过程中TTX漏穿,对检测的灵敏度和定量的准确性造成影响。羧基化多壁碳纳米管小柱相较于WCX柱和MCX柱,对样液中的TTX吸附量大、结合能力强,上样时能有效吸附TTX,在淋洗过程中也没有丢失。洗脱时用3 mL 0.1%乙酸-乙腈(8∶2,V/V)即可将TTX完全洗脱,洗脱液过膜后可直接上机检测,减少浓缩步骤,节省检测时间,提高工作效率。

    • 生物样品基质复杂,净化效果不佳时会产生较强的基质抑制效应,造成灵敏度降低和定量不准确。本方法评价了基质效应的影响,在空白提取液中加入一定浓度的TTX标准溶液,比较其与相应浓度标准溶液的色谱峰面积,比值为0.41~0.67。免疫亲和柱特异性强,经过净化处理,能有效除去基质干扰[18]。骆和东等[31]用C18柱净化织纹螺样品,检测结果为0.50 mg·kg–1和0.38 mg·kg–1,小鼠生物法结果为0.73 mg·kg–1和0.58 mg·kg–1;吴佳俊等[27]用乙酸溶液提取河鲀鱼肉中的TTX后上机,对比4根色谱柱的绝对回收率,TSK-GEL Amide 80柱和ACQUITY UPLC BEH Amide柱的回收率达到50%左右,Kinetex HILIC柱与ZIC-HILIC柱的回收率仅为5%左右。上述2种方法的回收率均偏低,这是由样品中的基质抑制效应造成的。而羧基化多壁碳纳米管在碱性条件下能很好地吸附结合样品中的TTX,且承载量高,之后用甲醇和纯水淋洗去除杂质,用LC-MS/MS分析时可减少因基质干扰对检测结果造成的影响。

    • 用0.1%甲酸-乙腈(1∶1,V/V )将TTX标准工作液逐级稀释成质量浓度分别为0.5 ng·mL–1、1 ng·mL–1、5 ng·mL–1、10 ng·mL–1和50 ng·mL–1的梯度标准工作液。以峰面积为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制工作曲线,线性回归方程为y=58 264.5x–4 145.33 (R2=0.999 7),TTX在0.3~50 ng·mL–1范围内表现良好。采用阴性样品加标方法,以3倍信噪比确定检出限(LOD)为0.3 μg·kg–1,以10倍信噪比确定定量限(LOQ)为1 μg·kg–1,空白样品与加标样品的MRM图谱见图2

      图  2  空白样品和10 μg·kg–1加标阴性样品经碳纳米管净化后的MRM图谱

      Figure 2.  MRM chromatograms of 10 μg·kg–1 spiked sample cleaned up by carbon nanotubes

    • 本研究的阴性织纹螺样品均采用GB 5009.206—2016的液相色谱-串联质谱法测定。称取2.00 g阴性织纹螺分别添加水平为1.00 μg·kg–1、10.00 μg·kg–1和100.00 μg·kg–1的TTX标准溶液,每个平行测定5次,其回收率见表3。加标样品在1.00~100.00 μg·kg–1添加水平的平均回收率为83.7%~91.4%,相对标准偏差为2.3%~8.6%。

      添加水平/μg·kg–1
      added amount
      回收率/%
      recovery
      相对标准偏差/%
      RSD
      1 91.4 2.3
      10 83.7 3.4
      100 84.8 8.6

      表 3  样品加标回收率与相对标准偏差

      Table 3.  Recovery of standard addition and relative standard deviation for tetrodotoxin

    • 本文用碳纳米管固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法对采自广东省湛江市的30个织纹螺样品进行检测,TTX毒素的质量分数为1.87~3.34 mg·kg–1,与TTX免疫亲和柱作对比参照结果相近,本方法回收率高,精密度好,适用于螺肉样品TTX的检测。

    • 在TTX样品检测分析工作中,通常采用SPE柱对样品进行上机前处理,但是TTX样品成分复杂,SPE净化效果并不理想[27]。本研究建立了一种高效、灵敏的检测织纹螺中TTX的LC-MS/MS方法。以1%乙酸甲醇溶液作为萃取剂,结合超声水浴法,对织纹螺样品中的TTX进行提取,在碱性条件下样品经过羧基化多壁碳纳米管净化,洗脱液用量少,可直接过滤膜上机检测,结合LC-MS/MS准确定量分析样品中的TTX。本方法步骤简单方便,洗脱液用量少,减少了洗脱液浓缩步骤,大大节省了样品处理和净化时间,在保证灵敏度的同时降低了实验成本,适用于对织纹螺样品中的TTX进行定量分析,是一种安全可靠的检测手段,为织纹螺的TTX检测提供新方法。但碳纳米管应用于TTX检测的研究还不多,许多条件仍需进一步深入探究。

(2)  表(3) 参考文献 (31) 相关文章 (20)

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