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基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

马艳平 郝乐 梁志凌 马江耀 李盈 柯浩 刘振兴 曹俊明

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基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

    作者简介: 马艳平(1984 — ),女,博士,助理研究员,从事水产病害学研究。E-mail: mayanping2292@163.com;
    通讯作者: 刘振兴, liuzhenxing81@126.com ; 曹俊明, junmcao@163.com
  • 中图分类号: S 917.1

Establishment of CyHV-3 pORF65 antibody detection method by indirect carp serum ELISA

    Corresponding author: Zhenxing LIU, liuzhenxing81@126.com ;Junming CAO, junmcao@163.com
  • CLC number: S 917.1

  • 摘要: 鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将pORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短 ORF65 (truncated ORF65) 插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-trunORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、BepiPred 1.0软件预测了pORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-modORF65。重组质粒分别转入BL21 (DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,pET32a-modORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 kD。此外,利用rProtein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清IgM,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的pORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测pEGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。
  • 图 1  pORF65序列分析结果

    Figure 1.  Result of sequence analysis of pORF65 protein

    图 2  pET32a-compORF65、pET32a-trunORF65质粒诱导表达结果

    Figure 2.  Result of induced expression of pET32a-compORF65 and pET32a-trunORF65 plasmid

    图 3  pORF65抗原表位优势区段融合PCR结果

    Figure 3.  SOE-PCR of pORF65 B cell eptitope segments

    图 4  pORF65重组蛋白Western-blot分析结果

    Figure 4.  Western blot analysis of pORF65 recombinant protein

    图 5  锦鲤血清IgM纯化结果

    Figure 5.  Result of purification of koi serum IgM

    表 1  ORF65扩增引物序列

    Table 1.  Sequence of ORF65 gene amplification

    引物
    primer
    序列
    sequence
    65Hind3CF CCC AAGCTTGCATGGTCTCGCCGCTCG (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)
    65XholCR CCG CTCGAGCTTGATGGTCGCGGCGGCCTTG (下划线为XhoⅠ酶切位点)
    65Hind3TF CCC AAGCTTGCCAAACCGTGGTGTATACC (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)
    65XholTR CCG CTCGAGCAGGGTAACTGTGTTGCTG (下划线为XhoⅠ酶切位点)
    65AFHind3 CCC AAGCTTGCTTTATGCCGAGTGATGTG (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)
    65AR GCCGTTACGGAACCAAT
    65BF ATTGGTTCCGTAACGGCGGCGGCGGCGGCAGCGCAAGCCTGCGCAGTG
    65BR AACTGTGTGAGCTTCTTG
    65CF CAAGAAGCTCACACAGTTGGCGGCGGCGGCAGCAAGTACTGCCCGAATGAG
    65CR TGCGCTTGTGGCATTGGC
    65DF GCCAATGCCACAAGCGCAGGCGGCGGCGGCAGCTACGGCGTTGGCAACAG
    65DR GGTATTGATGTCCGG
    65EF CCGGACATCAATACCGGCGGCGGCGGCAGCACCACCACCACCACCACAACCACACCG
    65ERXhol CCG CTCGAGGGTAACTGTGTTGCTGGC(下划线为XhoⅠ酶切位点)
     注:65Hind3CF/65XholCR为扩增ORF65全基因引物;65Hind3TF/65XholTR为扩增去掉信号肽与C端跨膜疏水区段的截短ORF65引物;65AFHind3/65AR、65BF/65BR、65CF/65CR、 65DF/65DR、65EF/65ERXhol为融合PCR引物  Note: 65Hind3CF/65XholCR represents ORF65 complete encoding sequence primer; 65Hind3TF/65XholTR represents truncated ORF65 gene primer without signal peptide and transmembrane hydrophobic segment; 65AFHind3/65AR, 65BF/65BR, 65CF/65CR, 65DF/65DR and 65EF/65ERXhol represent SOE-PCR primers.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-12-18
  • 录用日期:  2018-01-11
  • 刊出日期:  2018-06-01

基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

    作者简介:马艳平(1984 — ),女,博士,助理研究员,从事水产病害学研究。E-mail: mayanping2292@163.com
    通讯作者: 刘振兴, liuzhenxing81@126.com
    通讯作者: 曹俊明, junmcao@163.com
  • 广东省农业科学院动物卫生研究所,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东 广州 510640

摘要: 鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将pORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短 ORF65 (truncated ORF65) 插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-trunORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、BepiPred 1.0软件预测了pORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-modORF65。重组质粒分别转入BL21 (DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,pET32a-modORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 kD。此外,利用rProtein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清IgM,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的pORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测pEGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。

English Abstract

  • 鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(KHV),是一种双链线性DNA病毒,具有囊膜结构,自20世纪90年代报道以来已经在世界范围内流行,该病毒引起的锦鲤疱疹病毒病(KHVD)造成巨大的经济损失,严重威胁鲤 (Cyprinus carpio)、锦鲤 (C.carpio haematopterus)产业安全[1-5]

    在CyHV-3防治研究中基于病毒囊膜蛋白的DNA疫苗成为重要的研究方向,例如CyHV-3 ORF65构建的DNA疫苗对锦鲤表现出良好的免疫保护效果[6-8]。但是由于缺乏特异性抗体检测方法,无法准确评价其免疫效果。因此,为准确评价DNA疫苗免疫效果、制定免疫方案,需要建立高通量、特异性抗体检测方法作为CyHV-3 DNA疫苗研究的技术支撑。而CyHV-3囊膜蛋白抗原与抗鲤血清IgM抗体的制备是建立抗体检测方法的基础。

    病毒囊膜蛋白参与了病毒与宿主细胞的识别、互作、侵染等过程,可以诱导较强的体液免疫应答,是DNA疫苗研发的重要候选分子[9-10]。尽管鲤是一种重要的经济鱼类,但其血清IgM纯化仅见凝胶过滤层析制备的报道[11-13],亲和层析作为一种快速制备高纯度抗体的方法尚未应用于鲤血清IgM的纯化。

    本研究在密码子优化与预测CyHV-3 pORF65 B细胞表位优势区段的基础上,采用pET32a (+)/BL21系统重组表达pORF65 B细胞表位优势区段;采用rProtein G亲和层析纯化了锦鲤血清IgM,并制备了鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体;在此基础上初步建立了CyHV-3特异性抗体检测的间接ELISA方法,为进一步开展CyHV-3疫苗研究提供基础。

    • 鲤疱疹病毒3型HZ419株基因组DNA由本实验室提取并保存。大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α、BL21 (DE3)菌株、pET32a (+)质粒由实验室保存,pEGFP-ORF65 DNA疫苗重组质粒由前期实验构建[8]。Prime Star Max高保真酶、dNTP、DNA Maker为TaKaRa公司产品,内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司。质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Axygen公司。蛋白Maker购自Thermo公司。His Bind纯化试剂为Novagen公司产品。rProtein A、rProtein G亲和层析预装柱购自北京韦氏博慧色谱有限公司。Anti-His单克隆抗体购自南京金斯瑞公司。生物发光试剂盒购自Bio-Rad公司。其他试剂均为国产分析纯。20 g左右的锦鲤购自芳村花鸟鱼虫市场。小鼠购自南方医科大学实验动物中心。

    • 根据CyHV419株ORF65 (GenBank No. KP004895) 序列设计引物见表1。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

      引物
      primer
      序列
      sequence
      65Hind3CF CCC AAGCTTGCATGGTCTCGCCGCTCG (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)
      65XholCR CCG CTCGAGCTTGATGGTCGCGGCGGCCTTG (下划线为XhoⅠ酶切位点)
      65Hind3TF CCC AAGCTTGCCAAACCGTGGTGTATACC (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)
      65XholTR CCG CTCGAGCAGGGTAACTGTGTTGCTG (下划线为XhoⅠ酶切位点)
      65AFHind3 CCC AAGCTTGCTTTATGCCGAGTGATGTG (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)
      65AR GCCGTTACGGAACCAAT
      65BF ATTGGTTCCGTAACGGCGGCGGCGGCGGCAGCGCAAGCCTGCGCAGTG
      65BR AACTGTGTGAGCTTCTTG
      65CF CAAGAAGCTCACACAGTTGGCGGCGGCGGCAGCAAGTACTGCCCGAATGAG
      65CR TGCGCTTGTGGCATTGGC
      65DF GCCAATGCCACAAGCGCAGGCGGCGGCGGCAGCTACGGCGTTGGCAACAG
      65DR GGTATTGATGTCCGG
      65EF CCGGACATCAATACCGGCGGCGGCGGCAGCACCACCACCACCACCACAACCACACCG
      65ERXhol CCG CTCGAGGGTAACTGTGTTGCTGGC(下划线为XhoⅠ酶切位点)
       注:65Hind3CF/65XholCR为扩增ORF65全基因引物;65Hind3TF/65XholTR为扩增去掉信号肽与C端跨膜疏水区段的截短ORF65引物;65AFHind3/65AR、65BF/65BR、65CF/65CR、 65DF/65DR、65EF/65ERXhol为融合PCR引物  Note: 65Hind3CF/65XholCR represents ORF65 complete encoding sequence primer; 65Hind3TF/65XholTR represents truncated ORF65 gene primer without signal peptide and transmembrane hydrophobic segment; 65AFHind3/65AR, 65BF/65BR, 65CF/65CR, 65DF/65DR and 65EF/65ERXhol represent SOE-PCR primers.

      表 1  ORF65扩增引物序列

      Table 1.  Sequence of ORF65 gene amplification

    • ORF65基因及蛋白序列(GenBank No. KP004895、AJK93601.1)分析:采用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1 (http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm)进行稀有密码子分析;采用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜结构预测;采用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测;采用DNAstar软件、ABCpred (www.imtech.res.in/raghava/abcpred)、BepiPred 1.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ BepiPred/)进行抗原表位优势区段预测,并将截去信号肽与C端跨膜疏水片段的基因编码序列送金唯智公司进行密码子优化与序列合成。

    • 以CyHV-3 HZ419株DNA为模板,用引物65Hind3CF/65XholCR及Prime Star Max高保真酶PCR扩增ORF65全基因,反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,35个循环;72 ℃总延伸5 min,4 ℃保存。采用同样的方法,以金唯智公司优化密码子的合成序列为模板,用引物65Hind3TF/65XholTR扩增去掉信号肽与C端跨膜疏水区段的截短ORF65。将上述扩增产物通过Hind Ⅲ/Xho Ⅰ双酶切插入pET32a (+)载体,构建的重组质粒分别命名为pET32a-compORF65、pET32a-trunORF65,随后将重组质粒转入DH5α菌株,PCR筛选阳性转化菌株,并送测序鉴定后提取质粒,转入BL21 (DE3)表达菌株。挑取转化菌株,接种于Amp抗性的LB培养基中培养过夜,再按1∶100接种于100 mL LB新鲜培养基中,37 ℃、220 r·min–1培养至菌液光密度 (OD) 达到0.4~0.5后,分别加入0.2 mmol·L–1、0.8 mmol·L–1、1.5 mmol·L–1 IPTG于28 ℃、37 ℃诱导表达。参照Novagen PET表达系统手册进行蛋白表达与可溶性分析。

    •   1) pORF65 B细胞表位优势区段的融合PCR。根据1.2.2的预测结果,分别扩增5个pORF65 B细胞表位优势区段(A、B、C、D、E)。以金唯智公司优化密码子的合成序列为模板,分别利用引物65AFHind3/65AR、65BF/65BR、65CF/65CR、65DF/65DR、65EF/65ERXhol扩增A、B、C、D、E区段(引物序列见表1),除65D片段外,反应程序均采用94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃总延伸2 min,4 ℃保存。65D片段反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,47.5 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃总延伸2 min,4 ℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后,将扩增的片段切胶纯化,等体积(10 μL)混合,进行融合PCR扩增,反应程序采用94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,47.5 ℃ 50 s,72 ℃ 90 s,16个循环;72 ℃总延伸2 min。然后以融合后的PCR产物为模板,以65AFHind3/65ERXhol为引物,进行PCR扩增,反应程序采用94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,35个循环;72 ℃总延伸2 min,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

      2) pET32a-modORF65重组质粒的构建、表达与纯化。将上述PCR扩增产物切胶回收后通过Hind Ⅲ/Xho Ⅰ双酶切插入pET32a (+)载体,构建的重组质粒命名为pET32a-modORF65,后续蛋白表达与可溶性分析同1.2.3。选取最佳表达条件下的蛋白表达产物,采用Novagen His Bind蛋白纯化试剂盒进行纯化,纯化蛋白经BCA试剂盒定量后于 –80 ℃保存。

      3) 重组pORF65的Western-blot分析。上述纯化蛋白SDS-PAGE电泳后,经100 mA,1.5 h转至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭液37 ℃封闭2 h后PBST洗膜3次,加入1∶1 000稀释的HRP标记的抗His标签鼠单克隆抗体37 ℃孵育2 h,PBST洗膜5次后用Bio-Rad生物发光试剂盒检测。

    •   1) 锦鲤血清IgM的纯化。采集锦鲤血清,与4 mol·L–1 NaCl (pH 8.3)等体积混合,取1 mL加入2 mol·L–1 NaCl (pH 8.3)平衡后的rProteinG预装柱,室温静置15 min,2 mol·L–1 NaCl (pH 8.3)洗涤10个柱床,0.05 mol·L–1 Gly洗脱,收集洗脱液,1∶50加入Tris-HCl (pH 8.0)调节pH。纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析。纯化条带切胶后送美吉生物公司进行LC-MS/MS分析。

      2) 鼠抗锦鲤IgM的多克隆抗体的制备。以上述纯化的鲤IgM为抗原免疫小鼠(4只),共免疫3次,每次间隔2周,第1次抗原加等体积的弗氏完全佐剂,后2次加等体积的弗氏不完全佐剂,免疫剂量为50 μg·只–1,免疫途径为背部和腹部皮下多点注射。采血前3天用不加佐剂抗原腹腔注射加强免疫,剂量为50 μg·只–1。摘除眼球采血,分离血清采用rProtein A纯化小鼠IgG,– 80 ℃保存。

      3) ORF65 DNA疫苗的免疫。以实验室前期制备的真核重组表达质粒pEGFP-ORF65(包含ORF65全部编码序列)作为DNA疫苗肌肉注射免疫平均体质量20 g的锦鲤,免疫剂量为3 μg·尾–1,免疫3周后采集血清,– 80 ℃保存。

      4) 间接EILSA方法检测免疫血清抗体效价。将纯化的pORF65 (pET32a-modORF65)用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(CBS)稀释至160 μg·mL–1,100 μL·孔–1包被酶标板,4 ℃过夜,PBST洗涤3次;加入封闭液(1% BSA),37 ℃封闭1.5 h,PBST洗涤3次;加入1∶300稀释的锦鲤血清,100 μL·孔–1,25 ℃孵育1.5 h,PBST洗涤5次;加入100 μL·孔–11∶3 000稀释的鼠抗锦鲤多克隆抗体,37 ℃孵育2.5 h,PBST洗涤5次;加入100 μL·孔–11∶8 000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG,37 ℃孵育2 h,PBST洗涤5次;加入100 μL·孔–1 TMB工作液,37 ℃孵育30 min。加入50 μL·孔–1终止液,检测OD450

    • CyHV-3 419株ORF65全长1 785 bp,编码594个氨基酸。采用DNA star软件分析了pORF65的蛋白质二级结构、氨基酸亲水性、表面可能性、抗原性指数等参数,初步预测了pORF-65的B细胞表位优势区段,结合ABCpred、BepiPred 1.0的预测结果,最终确定5个B细胞表位优势区段,分别是Phe97-Gly172 (A)、 Ala199-Val284 (B)、Lys307-Ala361 (C)、 Tyr426-Thr445 (D)和 Thr473-Asn546 (E) (图1)。

      图  1  pORF65序列分析结果

      Figure 1.  Result of sequence analysis of pORF65 protein

    • pET32a-compORF65编码全长pORF65,其融合蛋白理论分子量分别为82.3 kD。经PCR鉴定、测序证实上述重组质粒读码框架正确,诱导表达后进行SDS-PAGE分析,结果显示该质粒未见明显表达(图2),稀有密码子分析显示,CyHV-3 ORF65全基因中低丰度密码子(threshold=10)有99个,严重影响了原核表达,因此本研究构建了密码子优化的pET32a-trunORF65质粒,其编码的融合蛋白理论分子量为77.2 kD,该质粒也未见明显表达(图2)。

      图  2  pET32a-compORF65、pET32a-trunORF65质粒诱导表达结果

      Figure 2.  Result of induced expression of pET32a-compORF65 and pET32a-trunORF65 plasmid

      电泳及测序证实融合PCR成功扩增了pORF65 B表位优势区段的编码序列(图3),序列大小为999 bp,以此为基础构建了pET32a-modORF65重组质粒,诱导表达获得预期分子量为56.4 kD的目的蛋白(图2)。可溶性分析表明,蛋白以包涵体形式表达。利用Novagen His Bind蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白,经抗His标签的鼠单克隆抗体Western-blot分析,在56.4 kD处杂交到明显的条带(图4)。

      图  3  pORF65抗原表位优势区段融合PCR结果

      Figure 3.  SOE-PCR of pORF65 B cell eptitope segments

      图  4  pORF65重组蛋白Western-blot分析结果

      Figure 4.  Western blot analysis of pORF65 recombinant protein

    • SDS-PAGE显示在>70 kD附近出现明显条带,推测为锦鲤IgM重链(图5),美吉公司LC-MS/MS质谱鉴定证实该蛋白为鲤血清IgM重链。以纯化的锦鲤IgM分3次免疫小鼠,加强免疫后3 d,摘除眼球采血,ELISA检测表明,制备的鼠抗血清效价>1∶160 000。

      图  5  锦鲤血清IgM纯化结果

      Figure 5.  Result of purification of koi serum IgM

    • 以本研究制备的鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体为检测抗体,以纯化的重组pORF65为包被抗原,建立的间接ELISA方法检测锦鲤免疫血清抗体效价,结果表明5尾免疫锦鲤血清OD450为分别为0.562、0.532、0.501、0.481、0.479,未免疫血清(阴性对照) OD450为0.231~0.21,P/N>2.1,本方法可以评价特异性抗体水平。

    • 病毒囊膜蛋白的跨膜区段包含大量的疏水性氨基酸,目前的研究表明疏水性区段可能影响了蛋白的原核表达。例如笔者在前期表达CyHV-3囊膜蛋白pORF59、pORF132的研究中发现,只有删除N端疏水区段后2个蛋白才可以高水平表达[4,14]。CyHV-3 pORF65结构更为复杂,存在多个疏水区段,借助软件分析,在保留B细胞表位的情况下删除疏水区段,最终表达了片段优化的CyHV-3 pORF65。该重组蛋白作为包被抗原,可以检测CyHV-3-ORF65 DNA疫苗免疫后,完整pORF65诱导的血清抗体。采用同样的思路,笔者将CyHV-3 pORF 131、CyHV-3 pORF 148进行了序列优化,也极大地提高了蛋白的原核表达水平(待发表)。

      鱼类免疫球蛋白纯化及其单抗、多抗制备是免疫评价、诊断方法建立的基础。Protein A、Protein G作为抗体结合蛋白在抗体纯化中得到广泛应用[15]。Protein A可以结合免疫球蛋白Fc片段,在鱼类IgM纯化中报道较多,但是该方法并不适用于所有鱼类IgM纯化[16]。鲤血清IgM的纯化仅见凝胶过滤层析的报道,Rombout等[17]采用了Sephacryl S-300 SF凝胶过滤层析,杨桂文等[11]、Zhang等[13]则尝试了Sephadex G-200凝胶过滤层析。笔者比较了凝胶过滤层析与Protein A亲和层析纯化黄鳍棘鲷 (Acanthopagrus latus) 血清IgM的效果,结果表明后者制备的IgM纯度更高[18];结合文献报道,一般认为亲和层析操作简便,适合小量、高纯度制备血清IgM[19-20],尤其在制备抗鱼IgM多克隆抗体中,亲和层析纯化的高纯度血清IgM更适合作为免疫抗原。然而本研究采用Protein A亲和层析未能纯化到鲤血清IgM,免疫球蛋白的结构差异导致了其与Protein A亲和力的不同[15],相对于Protein A而言,Protein G对不同亚型的小鼠、人的IgG具有更高的结合力[21],但是在鱼类血清IgM纯化中笔者尚未查阅到应用Protein G亲和层析的报道,本研究证明,Protein G对鲤血清IgM具有更高的亲和力,适用于鲤IgM的纯化。

      ELISA方法也已经应用于鲤血清特异性抗体水平评价与抗体诊断[22-25],这些方法分别依赖于2种抗鲤IgM单克隆抗体,Rombout等 [17]采用凝胶过滤层析纯化鲤IgM后制备的单克隆抗体WCI 12以及Aqua dignostic公司推出的商品化单克隆抗体。单克隆抗体特异性高,使用成本也较高,但是效价一般低于多克隆抗体,需要配合使用高浓度的(抗小鼠)酶标抗体[22,26],多克隆抗体在提高检测灵敏度与降低检测成本方面也具有自己的优势。

      本研究在重组表达CyHV-3 ORF65与制备鼠抗鲤多克隆抗体的基础上初步建立了pORF65特异性抗体检测ELISA方法,为进一步开展CyHV-3疫苗免疫研究提供了基础;本研究采用的蛋白表达策略与鲤血清IgM的rProtein G亲和层析纯化方法也为囊膜蛋白表达与鲤免疫学相关研究提供了借鉴。

参考文献 (26)

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