实验于2016年4月在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地进行。豹纹鳃棘鲈受精卵来自海南陵水养殖基地，空运至深圳后筛选上浮卵进行孵化，保持水温23~24 ℃，约30 h仔鱼孵化出膜。

仔鱼孵化后随机分为A、B、C 3组，每组2 000尾放入80 L养殖桶中，微充气，每天吸底换水1次，换水量为1/3。A组作为正常对照组，仔鱼开口后每天定时投喂经强化过的S型褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis); B、C组设为饥饿组，不予投饵。实验用水经三级过滤，保持水温23~24 ℃，盐度30~31，溶解氧(DO)≥5.0 mg·L^-1, pH 7.8~8.0。

实验开始后，每天早、晚定时检查。记录各组死亡情况，并从A、B组中各取10尾仔鱼，在带有目测微尺的显微镜下测量全长、卵黄囊长径、短径及油球直径，计算仔鱼的全长特定生长率(special growth rate，SGR)、卵黄囊体积和油球体积。其中，SGR=(lnl_m-lnl_n)/(m-n)×100%，l_m、l_n分别是m、n DPH(孵化后天数)仔鱼的全长，m、n分别表示m、n DPH; 卵黄囊体积=4/3×π×(r/2)²×R/2，r为卵黄囊短径，R为卵黄囊长径; 油球体积=4/3×π×(D/2)³，D为油球直径。B组仔鱼全部死亡实验结束。

豹纹鳃棘鲈仔鱼开口后每天早、晚定时从C组随机取出20尾仔鱼放入500 mL烧杯中进行投喂。3 h后将仔鱼取出，在显微镜下解剖观察仔鱼摄食情况，记录摄食的仔鱼数量并计算初次摄食率。初次摄食率=摄食仔鱼数/样本仔鱼数×100%。PNR的测定采用BLAXTER和HEMPEL^[11]的方法，以豹纹鳃棘鲈孵化后的DPH表示，每日检测饥饿仔鱼的初次摄食率，当初次摄食率低于最高初次摄食率的1/2时，即为仔鱼PNR的时间。

实验数据用平均值±标准差(X±SD)表示，运用SPSS 19.0软件进行t检验法统计分析。

豹纹鳃棘鲈受精卵为浮性卵，卵径为(0.90±0.04)mm，体积为(0.386 3±0.050 1)mm³。初孵仔鱼鱼体透明，身体前半部包在卵黄囊中，头部紧贴卵黄囊前端向内弯曲，两侧有2个圆形眼囊，未见色素，消化道细线状，尚未与外界连通(图 1-a)。仔鱼头朝下浮在水体表层，偶有窜动。0~2.0 DPH仔鱼头部、眼球出现色素并逐渐加深，胸鳍鳍褶明显，消化道变粗变弯曲，胃出现雏形，肛门与外界相通，仔鱼可平游，运动能力增强; 2.5 DPH仔鱼眼球布满黑色素，视觉形成，出现口裂，下颌突出，背部鳍褶色素加深，胸鳍呈叶片状，腹部膨胀，胃、肠分化(图 1-b)，仔鱼开始摄食，出现巡游、集群行为; 3.0~6.0 DPH对照组仔鱼体长增长明显，背鳍棘芽和腹鳍棘芽根基出现(图 1-c)，摄食能力和摄食量进一步增强加大; 饥饿组逐渐停止发育，头大身瘦，器官萎缩(图 1-d)，仔鱼先四处狂游，后游动减弱至静卧水底，死亡加剧。

图  1  饥饿对豹纹鳃棘鲈仔鱼形态发育的影响

Figure 1.  Effect of starvation on morphological development of P.leopardus larvae

初孵仔鱼卵黄囊饱满，长径为(0.84±0.08)mm，短径为(0.54±0.08)mm，体积为(0.130 5±0.046 0)mm³; 油球位于卵黄囊后端，直径为(0.17±0.01)mm，体积为(0.002 6±0.000 4)mm³(表 1)。豹纹鳃棘鲈内源性营养的吸收顺序为卵黄囊-油球，初孵仔鱼卵黄囊吸收迅速，第1天即消耗总体积的近80%，油球吸收相对较慢，消耗总体积约30%;2.0 DPH仔鱼卵黄囊剩余不足2%，油球剩余15%。经观察，2.5 DPH进入混合营养期阶段后，饥饿仔鱼对油球的吸收稍慢于正常投喂的对照组，3.0 DPH对照组仔鱼卵黄囊和油球完全消失，饥饿组卵黄囊消失，油球则还残留，至3.5 DPH完全吸收(表 1)。

表 2和图 2为豹纹鳃棘鲈全长变化情况。初孵仔鱼全长为(1.96±0.10)mm，随着卵黄囊的快速吸收，仔鱼在第1天生长迅速，1.0 DPH全长为(2.34±0.06)mm，之后增长速度稍放缓，3.5 DPH前2组仔鱼生长差异不明显(P>0.05)。3.5 DPH之后，随着卵黄囊和油球的耗尽，仔鱼进入外源性营养阶段，2组生长速率开始出现分化：对照组仔鱼通过摄食、吸收外界食物营养进入另一快速平稳生长阶段，至6.0 DPH平均全长达到3.27 mm，最大全长达到3.41 mm，显著高于同DPH的饥饿组仔鱼(P < 0.05);饥饿组仔鱼在3.5 DPH后则开始出现生理性萎缩，至6.0 DPH平均全长仅为2.48 mm，身体畸形，死亡殆尽。对照组仔鱼总体保持线性生长，全长(l)与DPH(d)符合线性关系式l=0.089 6d+2.016 9(R²=0.926 2)，饥饿仔鱼全长(l)与DPH(d)符合多项式l=-0.009 3d²+0.154 8d+1.939 8(R²=0.880 8)。2组仔鱼的SGR也有较大差异，对照组6.0 DPH仔鱼SGR为8.53%，远高于饥饿组仔鱼的3.38%。

图  2  饥饿对豹纹鳃棘鲈仔鱼生长的影响

Figure 2.  Effect of starvation on growth of P.leopardus larvae

水温为23~24 ℃，豹纹鳃棘鲈孵化率75%，2组仔鱼在2.0 DPH前出现大量“白苗”，48 h死亡率均超过30%。在开口及混合营养期前后2组仔鱼死亡稍放缓，至3.5 DPH各组均死亡约40%。3.5 DPH之后对照组仔鱼死亡率先增大后放缓并趋于稳定，6.5 DPH成活率为41%;饥饿组仔鱼则加速死亡，至6.5 DPH死亡率为100%(图 3)。

图  3  饥饿对豹纹鳃棘鲈仔鱼成活的影响

Figure 3.  Effect of starvation on survival of P.leopardus larvae

仔鱼2.5 DPH开口摄食，初始摄食率较低(20%); 之后初次摄食率迅速提升，3.0 DPH为55%;3.5 DPH仔鱼初次摄食率到达最高(65%); 随后逐渐下降，4.5 DPH为40%;5.0 DPH初次摄食率降至15%，低于最高初次摄食率的1/2，说明豹纹鳃棘鲈仔鱼耐受饥饿的临界点出现在4.5~5.0 DPH，即进入PNR。在水温23~24 ℃下豹纹鳃棘鲈仔鱼从开口到PNR为2.0~2.5 d，即具有初次摄食能力的时间为2.0~2.5 d，达到不可逆期的仔鱼大部分不能正常摄食，最终死亡而被淘汰(图 4)。

图  4  豹纹鳃棘鲈仔鱼初次摄食率

Figure 4.  Initial feeding rate of P.leopardus larvae

仔鱼生长发育按照营养来源划分一般要经历内源性营养期、混合营养期和外源性营养期。研究发现，在内源性营养期，豹纹鳃棘鲈的生长与其卵黄囊的吸收速度一致：仔鱼孵化后卵黄囊吸收迅速，1.0 DPH即消耗总体积80%，全长增长速度也达0.43 mm·d^-1，2.0 DPH卵黄囊消耗近20%，全长增长速度为0.11 mm·d^-1。这个阶段的仔鱼除全长增长速度明显外，消化、运动器官也得到快速发育，可见卵黄营养对于初期仔鱼至关重要，卵黄囊较大的鱼类往往饥饿耐受性更强，仔鱼更容易成活^[12]。2.5 DPH仔鱼开口摄食进入混合营养期，混合营养期是关系到仔鱼成活和发育的关键时期，仔鱼必须在短时间内通过捕食建立起外源性营养，否则就会蒙受进展性饥饿(progressive starvation)。这个阶段豹纹鳃棘鲈全长增长速度仅为0.04 mm·d^-1，猜测仔鱼残余卵黄囊的消耗主要用在了为建立外源营养而进行的运动器官发育和摄食运动耗能上。淡水鱼类的混合营养期一般为3~4 d^[13]，多数浮性卵海水鱼类的混合营养期仅为数小时到3 d^[14]，豹纹鳃棘鲈仔鱼在卵黄囊即将消耗尽前才开口摄食，混合营养期仅为0.5 d，属容易遭受饥饿威胁的鱼类。至3.0 DPH，豹纹鳃棘鲈进入外源性营养期，这个阶段对照组仔鱼因摄取外界营养恢复平稳生长状态; 而饥饿组仔鱼因为受到饥饿胁迫鱼体开始出现生理性萎缩，3.5~6.0 DPH平均全长减少了0.19 mm，多数仔鱼发育畸形。豹纹鳃棘鲈生长情况基本符合FARRIS^[15]对仔鱼早期生长划分的3个相期，即孵化时的快速生长期、卵黄囊消失前后的慢速生长期、摄食仔鱼建立外源性营养后的稳定生长期或饥饿仔鱼不能建立外源性营养的萎缩期。此外，像大多数鱼类一样，豹纹鳃棘鲈仔鱼油球的吸收比卵黄囊慢，更有少数鱼类甚至在卵黄囊完全消失后油球才开始吸收，这种先卵黄囊后油球的吸收顺序可能是由于仔鱼早期生长的能量来源是按照先蛋白质后脂肪的顺序获得。

鱼类仔鱼在遭受饥饿胁迫时，为了提高成活和摄食的几率，在其生长发育、形态和行为方面常会出现一系列的适应性反应。在混合营养阶段，饥饿状态的豹纹鳃棘鲈仔鱼油球要比正常投喂迟0.5 d耗尽，这是因为饥饿会延缓早期仔鱼对内源性营养的利用速率，从而延长其开口摄食的时间，提高成活几率，这点在褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)^[16]、黑莓鲈(Pomoxis nigromacufatus)^[17]等鱼类中均得到证实，但其内在作用机制尚不明确。内源性营养消耗完毕后，随着饥饿时间的延长，豹纹鳃棘鲈仔鱼为保证摄食活动耗能，各组织器官被代谢消耗，导致发育逐渐停滞，出现脑部萎缩、身体畸形等一系列形态学特征，待自身储备能量不足时生长也受到了抑制。鲈(Lateolabrax maculatus)^[18]、杂交鳢(Channa maculate♀×Channa argus♂)^[19]、唇(Hemibarbus labeo)^[20]等多种鱼类在遭受饥饿胁迫时也都会出现类似的生理性萎缩或变性，这是骨骼系统尚未发育完善的仔鱼面对饥饿威胁而形成的一种适应性的生态对策，即延长耐受饥饿时间和保持一定的发育、生长速度之间的替代效应^[21]。这种潜在的生理适应机制在行为方面主要表现为饥饿仔鱼在卵黄囊消失后并没有出现明显的集群行为，且开始运动加剧，四处狂游。在自然条件下，这无疑可以增加仔鱼与食物的相遇几率，以便通过摄取外界营养来恢复自身正常生长发育; 但是剧烈运动同时也增加了能量消耗，仔鱼一旦无法获取食物便会加剧衰弱直至死亡。因为饥饿胁迫通常会造成仔鱼在形态和行为上出现异常，因此通过测量身体各部分形态比例，或是通过机体某些特殊体态特征如“胸角”以及异常行为现象，可以准确判别仔鱼的饥饿程度。豹纹鳃棘鲈属科鱼类，可以考虑像点带石斑鱼Epinephelus malabaricus)^[22]一样，以鳍棘的发育程度作为仔、稚鱼饥饿的指标。

仔鱼初次摄食率的高低与最高摄食率持续时间的长短可以用来判断仔鱼的摄食能力，而PNR的长短可以判定仔鱼耐受饥饿的能力^[23]。不同种类的仔鱼饥饿后的初次摄食率随DPH变化而趋势各异，一般可分为2种类型：1)如金鲫(Carassius auratus serum)^[24]、斑鳜(Siniperca scherzeri)^[25]，这类仔鱼开口时初次摄食率较低，后逐渐升高，达到最高值后又迅速下降; 2)如赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)^[26]、长薄鳅(Leptobotia elongata)^[27]，仔鱼开口时初次摄食率较低，后逐渐升高，在最高值保持一段时间后再迅速下降。仔鱼摄食能力越强，在同一时间发生摄食行为的个体就越多，初次摄食率就越高，在较高摄食率的时间也就会延长。豹纹鳃棘鲈属于第1种类型，仔鱼开口时初次摄食率仅20%，之后初次摄食率逐渐提高，3.5 DPH初次摄食率达到最高65%，然后迅速下降，仔鱼在较高初次摄食率持续时间很短，摄食能力较弱。

PNR是衡量鱼类仔鱼耐饥饿能力的重要指标，仔鱼从初次摄食到PNR的时间越长，建立外源性营养关系的可能性就越大; 反之则越小^[28]。哲罗鱼(Hucho taimen)^[29]从初次摄食到PNR时间为18~19 d、倒刺鲃(Spinibarbus denticulatus)^[30]为12 d，这些鱼类PNR发生较晚，仔鱼对饥饿通常表现出很强的忍耐能力。豹纹鳃棘鲈仔鱼从初次摄食到PNR的时间为2.0~2.5 d，与云纹石斑鱼(E.moara)^[31]、斜带石斑鱼(E.coioides)^[32]等鱼类类似，这类鱼PNR发生较早，仔鱼必须在短时间内建立外源性营养，否则将面临死亡威胁。实际上，包括水温在内的多种因素都会影响PNR的发生时间，在一定范围内，温度越高，PNR发生越早。为了在比较不同鱼类PNR时更具有合理性，有学者提出PNR有效积温(sum of effective temperature)的概念^[33]，其计算公式可表示为：实验过程平均水温(℃)×PNR时间(d)。大部分种类仔鱼PNR有效积温范围为100~250 ℃·d^-1[34]，豹纹鳃棘鲈的PNR有效积温为112 ℃·d^-1，处于相对较下游的位置，再次证明仔鱼耐受饥饿和建立外源性营养的能力较弱，这可能与仔鱼个体及卵黄囊体积较小有关，是其在长期进化过程中形成的一种对饵料环境的适应性策略。

成活率是衡量鱼类苗种繁育工作成功与否的重要指标，而饥饿一直被认为是引起早期仔鱼大量死亡的主要原因之一。该实验中由于受到饥饿胁迫，饥饿组豹纹鳃棘鲈仔鱼在其内源性营养消耗完毕后，死亡量几乎呈指数增加，仅在6.5 DPH即全部死亡。一般认为仔鱼50%死亡率出现在PNR之后，意味着在PNR前饥饿仔鱼如能得到食物则尚有较大恢复可能，反之可能性较小^[35]。豹纹鳃棘鲈饥饿仔鱼50%死亡率出现在4.0~4.5 DPH，位于PNR之前，说明仔鱼摄食能力较弱，开口后能够及时获得饵料对仔鱼的成活意义重大，这也提示在育苗生产中要尽量争取仔鱼的开口时间，获得较高的开口率是保障出苗量的重要途径。结合混合营养期和PNR时间，研究认为在水温23~24 ℃下豹纹鳃棘鲈最适的初次投饵时间为2.5~3.5 DPH。另外，2组仔鱼48 h死亡率均超过30%，这可能是温水偏低等生态因子造成，豹纹鳃棘鲈最佳育苗的生态因子有待进一步研究确定。