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花鲈b2m基因cDNA的克隆及表达分析

葛婉仪 雷丽娜 蒋昕彧 李霞 孙兆盛 王伟 高谦

引用本文:
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花鲈b2m基因cDNA的克隆及表达分析

    作者简介: 葛婉仪 (1999—),女,本科生,研究方向为鱼类免疫学与病害防控。E-mail:1103617638@qq.com;
    通讯作者: 高谦, qgao@shou.edu.cn
  • 中图分类号: S 917.4

Molecular cloning and expression pattern analysis of b2m from spotted sea bass (Lateolabrax maculatus)

    Corresponding author: Qian GAO, qgao@shou.edu.cn
  • CLC number: S 917.4

  • 摘要: 为探究花鲈 (Lateolabrax maculatus) b2m (Beta-2 microglobulin) 基因对细菌和病毒感染的响应,该研究通过RACE-PCR扩增获得了花鲈b2m基因,该基因cDNA全长为1 383 bp,开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 为357 bp,编码118个氨基酸。所推测的编码蛋白与已报道的鱼类B2m的氨基酸序列相似度为44.8%~63.2%。基因共线性分析显示,b2m基因座位置在鱼类基因组中高度保守。利用实时荧光定量PCR检测花鲈b2m基因在各组织器官中的分布,结果表明花鲈b2m在所检测组织器官中均有表达,脾脏中表达量最高,鳃、头肾和脑中次之。通过腹腔注射脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS)、聚肌苷-脱氧胞苷酸 (Poly I:C) 和迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda, Edw) 研究花鲈感染后b2m的表达变化,结果显示3种刺激物均可诱导花鲈b2m在鳃、肠、头肾、脾脏组织中表达上调,推测b2m基因参与了花鲈抗细菌、抗病毒感染的免疫应答过程。
  • 图 1  花鲈b2m的核酸和氨基酸序列

    Figure 1.  Nucleotide and deduced amino acid sequence from b2m gene of L. maculatus

    图 2  花鲈B2m与其他物种B2m的氨基酸序列比对

    Figure 2.  Multiple alignment of B2m amino acid sequences from L. maculatus and other species

    图 3  依B2m氨基酸序列构建的系统进化树

    Figure 3.  Phylogenetic tree of B2m from various species

    图 4  花鲈B2m二级和三级结构预测

    Figure 4.  Prediction of secondary structure and tertiary structure of L. maculatus B2m

    图 5  花鲈和齿舌鲈的b2m基因结构比较

    Figure 5.  Comparison of b2m gene structure between L. maculatus and D. labrax

    图 6  智人、珍珠鸟、红原鸡、抹香鲸、斑马鱼、半滑舌鳎和花鲈中b2m基因的共线性分析图

    Figure 6.  Synteny diagram of b2m gene loci in H. sapiens, T. guttata, G. gallus, P. catodon, D. rerio, C. semilaevis and L. maculatus

    图 7  花鲈b2m的组织表达模式

    Figure 7.  Expression level of L. maculatus b2m mRNA in different tissues

    图 8  腹腔注射LPS、Poly (I:C)、Edw对花鲈b2m表达调控的影响

    Figure 8.  Effect of intraperitoneal injection with LPS, Poly (I:C) and Edw on regulation of b2m expression in L.maculatus

    表 1  实验中用到的引物

    Table 1.  Primers used in this experiment

    引物名称
    Primer name
    引物序列 (5'–3')
    Primer sequence
    用途
    Purpose
    b2m-F CATGAAGATGTTTGTCTGCGCA 中间片段克隆
    b2m-R GAGAACTGGCACTACCACCT 中间片段克隆
    b2m-5'R1 AGTGTTCGACAAGCCCAACAC 5'RACE-PCR
    b2m-5'R2 TCTGCTCTGCCTCCTGGCGCTTT 5'RACE-PCR
    b2m-3'F1 AGGAGGACTGGCACTACCACCT 3'RACE-PCR
    b2m-3'F2 ATGGAGAGTTAATACCTGAAGCC 3'RACE-PCR
    b2m-CF AGAGCGACTGAAGGTGAAG 序列验证
    b2m-CR GGTGTACATTTGGAGATAAATGG 序列验证
    b2m-qF TCGACAAGCCCAACACCT qPCR
    b2m-qR CAAAGGAGACGACTACGCCT qPCR
    EF1α-qF ATCTCTGGATGGCACG GAGA qPCR
    EF1α-qR CAGTGTGGTTCCGCTA GCAT qPCR
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    表 2  用于序列比对和系统进化树构建所用物种的信息

    Table 2.  Information of species used for sequence alignment and construction of phylogenetic tree

    物种
    Species
    氨基酸数量
    Number of amino acids
    相似度
    Similarity /%
    登录号
    Accession No.
    C. carpio 116 47.20 Q03422.1
    犀角金线鲃 S. rhinocerous 116 48.00 XP_016430127.1
    齐口裂腹鱼 S. prenanti 116 49.60 QEE82339.1
    斑马鱼 D. rerio 116 45.60 Q04475.1
    斑点叉尾鮰 I. punctatus 116 50.40 O42197.1
    青鳉 O. latipes 116 44.80 Q90ZJ6
    M. miiuy 116 48.00 ADV36787.1
    白斑狗鱼 E. lucius 116 44.80 ACO14540.1
    大西洋鲑 S. salar 116 50.40 AAG17537.1
    虹鳟 O. mykiss 116 52.00 AAB04663.1
    玻璃梭鲈 S. vitreus_ 116 49.60 AAW65850.1
    欧洲齿舌鲈 D. labrax 116 48.80 CBJ56267.1
    半滑舌鳎 C. semilaevis 118 48.00 ACR38919.1
    大黄鱼 L. crocea 118 63.20 XP_010753212.1
    智人 H. sapiens 119 38.40 NP _004039.1
    草原田鼠 M. ochrogaster 119 36.80 XP_005364420.1
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-02-22
  • 录用日期:  2020-05-29
  • 网络出版日期:  2020-10-21

花鲈b2m基因cDNA的克隆及表达分析

    作者简介:葛婉仪 (1999—),女,本科生,研究方向为鱼类免疫学与病害防控。E-mail:1103617638@qq.com
    通讯作者: 高谦, qgao@shou.edu.cn
  • 上海海洋大学/水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室/水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306

摘要: 为探究花鲈 (Lateolabrax maculatus) b2m (Beta-2 microglobulin) 基因对细菌和病毒感染的响应,该研究通过RACE-PCR扩增获得了花鲈b2m基因,该基因cDNA全长为1 383 bp,开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 为357 bp,编码118个氨基酸。所推测的编码蛋白与已报道的鱼类B2m的氨基酸序列相似度为44.8%~63.2%。基因共线性分析显示,b2m基因座位置在鱼类基因组中高度保守。利用实时荧光定量PCR检测花鲈b2m基因在各组织器官中的分布,结果表明花鲈b2m在所检测组织器官中均有表达,脾脏中表达量最高,鳃、头肾和脑中次之。通过腹腔注射脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS)、聚肌苷-脱氧胞苷酸 (Poly I:C) 和迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda, Edw) 研究花鲈感染后b2m的表达变化,结果显示3种刺激物均可诱导花鲈b2m在鳃、肠、头肾、脾脏组织中表达上调,推测b2m基因参与了花鲈抗细菌、抗病毒感染的免疫应答过程。

English Abstract

  • 花鲈 (Lateolabrax maculatus) 属鲈形目、鮨科、花鲈属,是我国重要的海产经济鱼类,主要分布于渤海至南海的近海区域以及通海的江河水域。花鲈生长快、适应性广、味道鲜美,养殖产量居我国海水养殖鱼类前列[1]。随着花鲈养殖规模化、集约化发展,病害成为制约花鲈养殖业可持续发展的重要因素[2],研究花鲈抵御病原微生物的免疫应答机制将为病害防治提供理论依据。

    B2m蛋白属于免疫球蛋白超家族成员。B2m与MHC Ⅰ类分子的重链及抗原多肽在内质网中形成复合体,随后转运至细胞表面,被CD8+细胞毒性T细胞 (CD8+ cytotoxic T cell, CTL) 通过其T细胞受体 (T cell receptor, TCR) 识别并结合,进而诱导细胞免疫反应[3]。若b2m基因存在缺陷,MHC Ⅰ类分子不能稳定存在于细胞表面,免疫系统对感染的应答相应会受到抑制[4]。对鱼类、爬行类、鸟类和哺乳类动物中已报道的相关基因序列进行比对分析发现,相对于MHC Ⅰ重链基因的高度多态性,b2m基因保守性较高;通过比较哺乳动物和鱼类的B2m蛋白三维结构,发现B2m上结合MHC Ⅰ类分子的位点相对保守,这可能是B2m与MHC Ⅰ在抗原选择压力下共同进化的结果[5]。基于b2m基因在机体免疫防御中的重要性,在鱼类中,已有西伯利亚鲟 (Acipenser baeri)[6]、玻璃梭鲈 (Stizostedion vitreum)[7]、草鱼 (Ctenopharyngodon idellus)[8]、斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)[9]、半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis)[10]、护士鲨 (Ginglymostoma cirratum)[11]、齿舌鲈 (Dicentrarchus labrax)[12]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[13]、斑马鱼 (Danio rerio)[14]、大黄鱼 (Larimichthys crocea)[15]、尖吻鲈(Lates calcarifer)[16]、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)[17]、鲤 (Cyprinus carpio)[18]、青鳉(Oryzias latipes)[19]、鮸鱼 (Miichthys miiuy)[20]、真鲷 (Pagrosomus major)[21]、黄尾 (Seriola lalandi)[21]和虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)[22]b2m基因的研究报道。

    本研究克隆了花鲈b2m基因,运用实时荧光定量PCR (Real-time Quantitive PCR, RT-qPCR) 技术在转录水平分析花鲈b2m的组织表达模式,以及脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS)、聚肌苷-脱氧胞苷酸Poly(I:C)和迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda, Edw) 刺激后花鲈b2m在各组织器官中表达变化情况,为探究花鲈b2m基因在抗感染免疫响应中的功能奠定基础。

    • 实验所用的花鲈采自杭州萧湘水产养殖场,平均体长(20±3.16) cm、体质量(200±5.32) g (n=106),实验前暂养1周,水温为 (23±2) ℃。随机选取6尾花鲈进行解剖,分别取肝脏、脾脏、肠、头肾、皮肤、鳃和脑组织各约200 mg,按照Trizol (Invitrogen,美国) 使用说明抽提花鲈总RNA。通过1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) 超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度。利用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) 合成cDNA第一链,参照SMART RACE cDNA amplification kit (TaKaRa,日本) 说明书反转录合成用于RACE-PCR的cDNA模板。

    • 根据大黄鱼、黄金鲈 (Perca flavescens)、齿舌鲈b2m基因序列 (GenBank登录号分别为LOC104938519、LOC114550153和FN667961.1) 设计引物 (表1),扩增目的基因的中间片段。PCR反应体系为:Premix Taq (TaKaRa,日本) 10 μL,正反向引物 (10 μmol·L−1) 各1 μL,cDNA模板1 μL,用ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃ 10 min。参考吴平等[23]的方法,采用降落PCR和巢式PCR扩增cDNA的5'和3'末端。利用胶回收试剂盒 (Omega) 回收目的片段,连接pMD19-T载体 (TaKaRa),转化DH5α,筛选阳性克隆送金唯智生物技术有限公司 (苏州) 测序。

      引物名称
      Primer name
      引物序列 (5'–3')
      Primer sequence
      用途
      Purpose
      b2m-F CATGAAGATGTTTGTCTGCGCA 中间片段克隆
      b2m-R GAGAACTGGCACTACCACCT 中间片段克隆
      b2m-5'R1 AGTGTTCGACAAGCCCAACAC 5'RACE-PCR
      b2m-5'R2 TCTGCTCTGCCTCCTGGCGCTTT 5'RACE-PCR
      b2m-3'F1 AGGAGGACTGGCACTACCACCT 3'RACE-PCR
      b2m-3'F2 ATGGAGAGTTAATACCTGAAGCC 3'RACE-PCR
      b2m-CF AGAGCGACTGAAGGTGAAG 序列验证
      b2m-CR GGTGTACATTTGGAGATAAATGG 序列验证
      b2m-qF TCGACAAGCCCAACACCT qPCR
      b2m-qR CAAAGGAGACGACTACGCCT qPCR
      EF1α-qF ATCTCTGGATGGCACG GAGA qPCR
      EF1α-qR CAGTGTGGTTCCGCTA GCAT qPCR

      表 1  实验中用到的引物

      Table 1.  Primers used in this experiment

    • 对所获得的b2m基因的全长cDNA序列,用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 查找开放阅读、ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) 预测蛋白的理化性质、SignalP 4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 预测信号肽、ScanProsite (http://prosite.expasy.org/) 预测蛋白结构域、NetPhos 3.1 Sever (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) 和NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 预测蛋白磷酸化和糖基化位点、PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 和Swiss-model (https://swissmodel.expasy.org/) 预测花鲈B2m的二级和三级结构。运用Blast检索同源序列,用DNAMAN软件进行氨基酸序列多重比对;利用MEGA X软件,选择最大似然法 (maximum likelihood, ML) 构建系统进化树,采用自举检验 (Bootstrap test) 分析系统树各分支的支持率,自举值为10 000。

    • 采用RT-qPCR技术,用LightCycler® 480 (Roche Biochemicals,瑞士) 检测花鲈b2m基因在肝脏、脾脏、肠、头肾、皮肤、鳃、脑组织中mRNA水平的组织表达模式。以延伸因子1α (Elongation factors 1α, EF1α) 作为内参基因,相关引物见表1;RT-qPCR的反应体系、反应条件以及标准曲线的构建参照吴平等[23]的方法,并对实验数据进行溶解曲线分析。

    • 100尾健康花鲈随机分为3个实验组和1个对照组,每组各25尾。3个实验组和对照组的每尾花鲈分别腹腔注射200 μL的Poly (I:C) (5 μg·g–1)、LPS (4 μg·g–1)、迟缓爱德华氏菌PBS悬液 (4×107 CFU·mL–1) 以及同体积无菌PBS。注射后按5个时间点 (第6、第12、第24、第48和第72小时) 依次取样,每次每组各取5尾,麻醉后解剖鱼体,取鳃、肠、脾脏和头肾等组织,采用Trizol法提取总RNA,按照Hifair™ Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus,翊圣,上海) 说明书,反转录合成用于荧光定量的模板cDNA。RT-qPCR的反应体系、反应条件以及标准曲线的构建参照吴平等[23]的方法,并对实验数据进行溶解曲线分析。

    • 克隆获得花鲈b2m基因cDNA全长1 383 bp,其中5'端非编码区 (Untranslated region, UTR) 117 bp,3' UTR 909 bp,开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 为357 bp,可编码118个氨基酸。预测其相对分子质量为13.2 kD,理论等电点为5.40。预测肽链N端有21个氨基酸残基的信号肽 (1~21 aa),1个Igc1结构域 (41~111 aa)。预测有9个正电荷氨基酸残基、14个负电荷氨基酸残基,其中亮氨酸 (Leu) 含量最高 (9.3%)。苏氨酸 (Thr) 和酪氨酸 (Tyr) 磷酸化位点各有2个 (图1)。

      图  1  花鲈b2m的核酸和氨基酸序列

      Figure 1.  Nucleotide and deduced amino acid sequence from b2m gene of L. maculatus

    • 用DNAMAN软件对不同物种B2m蛋白的氨基酸序列进行多重序列比对 (图2)。花鲈B2m与大黄鱼的相似度最高 (63.20%),与齿舌鲈、半滑舌鳎、斑马鱼、智人 (Homo sapiens)、草原田鼠 (Microtus ochrogaster) 的相似度分别为48.80%、48.00%、45.60%、38.40%、36.80%。比对发现共有19个氨基酸位点完全一致,均含有2个高度保守的半胱氨酸残基,其间可形成分子内部二硫键。比对的所有B2m蛋白均含有1个与免疫功能相关的免疫球蛋白样结构域 (Immunoglobulin c1-Type, Igc1,图2)。

      图  2  花鲈B2m与其他物种B2m的氨基酸序列比对

      Figure 2.  Multiple alignment of B2m amino acid sequences from L. maculatus and other species

      依B2m氨基酸序列构建的分子系统进化树显示,花鲈和大黄鱼聚为一支 (自举支持率达99%),同属鲈形目的齿舌鲈、玻璃梭鲈、鮸鱼与青鳉聚为一大支 (支持率为93%),然后进一步以69%的支持率与花鲈和大黄鱼聚为一簇,该簇中除青鳉外都属鲈形目鱼类。鲤形目、鲑形目鱼类也分别以99%和97%的支持率各聚为一支 (图3)。

      图  3  依B2m氨基酸序列构建的系统进化树

      Figure 3.  Phylogenetic tree of B2m from various species

      物种
      Species
      氨基酸数量
      Number of amino acids
      相似度
      Similarity /%
      登录号
      Accession No.
      C. carpio 116 47.20 Q03422.1
      犀角金线鲃 S. rhinocerous 116 48.00 XP_016430127.1
      齐口裂腹鱼 S. prenanti 116 49.60 QEE82339.1
      斑马鱼 D. rerio 116 45.60 Q04475.1
      斑点叉尾鮰 I. punctatus 116 50.40 O42197.1
      青鳉 O. latipes 116 44.80 Q90ZJ6
      M. miiuy 116 48.00 ADV36787.1
      白斑狗鱼 E. lucius 116 44.80 ACO14540.1
      大西洋鲑 S. salar 116 50.40 AAG17537.1
      虹鳟 O. mykiss 116 52.00 AAB04663.1
      玻璃梭鲈 S. vitreus_ 116 49.60 AAW65850.1
      欧洲齿舌鲈 D. labrax 116 48.80 CBJ56267.1
      半滑舌鳎 C. semilaevis 118 48.00 ACR38919.1
      大黄鱼 L. crocea 118 63.20 XP_010753212.1
      智人 H. sapiens 119 38.40 NP _004039.1
      草原田鼠 M. ochrogaster 119 36.80 XP_005364420.1

      表 2  用于序列比对和系统进化树构建所用物种的信息

      Table 2.  Information of species used for sequence alignment and construction of phylogenetic tree

    • PSIPRED在线分析结果表明B2m蛋白存在9.32% α螺旋、20.51% β折叠、60.17%无规则卷曲结构 (图4)。由Swiss-model预测的花鲈B2m的3D结构模型与蛋白质数据库中斑马鱼模板 (登录号4m9o.1.A) 相似,两者氨基酸序列相似度达54.08%。

      图  4  花鲈B2m二级和三级结构预测

      Figure 4.  Prediction of secondary structure and tertiary structure of L. maculatus B2m

    • 花鲈和舌齿鲈b2m的基因组序列分析显示,花鲈b2m基因序列含有4个外显子和3个内含子,齿舌鲈则含有3个外显子、2个内含子,两者外显子2的长度均为273 bp,花鲈和舌齿鲈b2m基因结构较为相似,主要差异在于花鲈的外显子2和4之间插入了40 bp的外显子3 (图5)。

      图  5  花鲈和齿舌鲈的b2m基因结构比较

      Figure 5.  Comparison of b2m gene structure between L. maculatus and D. labrax

      查找b2m基因在智人、抹香鲸 (Physeter catodon)、红原鸡 (Gallus gallus)、珍珠鸟 (Taeniopygia guttata)、斑马鱼、半滑舌鳎及花鲈基因组中的位置信息,分析其所在染色体上多个基因的线性分布关系,结果显示PATL2基因座位置在哺乳类和鸟类中高度保守,SPG11和TRIM69基因座在哺乳类中保守,SNX1、TERB2和RPS17基因座在鸟类中保守,irk3基因座则在鱼类中高度保守 (图6)。

      图  6  智人、珍珠鸟、红原鸡、抹香鲸、斑马鱼、半滑舌鳎和花鲈中b2m基因的共线性分析图

      Figure 6.  Synteny diagram of b2m gene loci in H. sapiens, T. guttata, G. gallus, P. catodon, D. rerio, C. semilaevis and L. maculatus

    • RT-qPCR结果显示,花鲈b2m在所检测的脾脏、鳃、大脑、头肾、皮肤、肠、肝脏等组织器官中呈组成型表达,且在脾脏中表达水平最高,在鳃、头肾、大脑中次之,在皮肤、肠、肝脏中表达水平相对较低 (图7)。

      图  7  花鲈b2m的组织表达模式

      Figure 7.  Expression level of L. maculatus b2m mRNA in different tissues

    • 腹腔注射LPS后,花鲈b2m基因mRNA的表达量在鳃组织中呈先抑后扬的趋势,但与对照组相比差异不显著 (图8-a);在肠中整体呈上调表达,第24小时表达上调达到高峰 (图8-b);头肾中b2m基因表达总体上受LPS下调影响,且在第12小时下调显著 (图8-c);在脾脏中整体呈上调表达,在第72小时显著上调 (图8-d)。腹腔注射Poly (I:C) 后,花鲈b2m基因mRNA在所检测各组织器官中基本呈上调表达,鳃 (图8-e) 和肠 (图8-f) 中分别在第48和第12小时显著上调,其他时间点上调不显著;头肾中整体呈上调表达,第24 小时极显著上调 (图8-g);在脾脏中上调幅度更大,第12 小时表达量达到高峰,约为对照组的10倍(图8-h)。 腹腔注射人工感染迟缓爱德华氏菌后,b2m基因mRNA表达量在花鲈鳃中第48小时显著上调,表达量达到峰值 (图8-i);在肠中第12和第24小时显著上调 (图8-j);在头肾中第6、第24和第48小时极显著上调 (图8-k);在脾脏中上调幅度最大,第12小时极显著上调,约为对照组的40倍 (图8-l)。

      图  8  腹腔注射LPS、Poly (I:C)、Edw对花鲈b2m表达调控的影响

      Figure 8.  Effect of intraperitoneal injection with LPS, Poly (I:C) and Edw on regulation of b2m expression in L.maculatus

    • 适应性免疫相关基因包括Ig重链和轻链、TCR、MHC I/II类和TAP相关蛋白,均与机体抗感染免疫应答密切相关[19,24]。B2m蛋白属于免疫球蛋白超家族成员,构成MHC Ⅰ类复合体的轻链部分[25-26],能促进抗原肽和MHC Ⅰ类分子的结合[27],是构成MHC Ⅰ类分子四聚体的关键组分[28]。本研究首次通过RACE-PCR获得花鲈b2m基因的全长cDNA序列,推测编码的氨基酸序列含1个免疫球蛋白样结构域Igc1,与尖吻鲈B2m的Igc1结构域的序列高度相似[15]。所推测的花鲈B2m氨基酸序列与其他鱼类的相似度介于44.8%~63.2%,与哺乳类的相似度也较高;分子系统发育分析显示花鲈B2m和大黄鱼的聚为一支,与鲈形目鱼类聚为一大簇,鲤形目、鲑形目鱼类则分别聚簇,说明本研究结果与传统分类学所描述的亲缘关系相吻合。

      已有研究表明不同物种的b2m基因结构存在差异,在鲟、玻璃梭鲈、草鱼、鲶、半滑舌鳎、齿舌鲈、高鳍白眼鲛 (Carcharhinus plumbeus) 中含有3个外显子,人、鼠、鸡、斑马鱼含有4个外显子,而牙鲆 b2m基因只有1个外显子[12]。本研究中花鲈b2m有4个外显子和3个内含子,与齿舌鲈b2m基因外显子2的大小一致,说明鲈形目鱼类b2m基因结构具有一定保守性。本研究对花鲈b2m基因共线性分析的结果进一步支持了鱼类b2m基因座在基因组中的位置高度保守的观点。

      RT-qPCR结果显示,花鲈b2m基因在所检测组织中呈组成型表达,且在头肾和脾脏中呈高水平表达,这一结果与头肾和脾脏在鱼类免疫系统的重要性相符[2, 29],也暗示花鲈b2m是参与免疫应答过程的重要因子。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分,是一种细菌内毒素,其通过存在于宿主细胞表面的Toll样受体 (Toll-like Receptor, TLR) 起作用;Poly (I:C) 则是一种模拟病毒核苷酸作用的合成双链RNA[30]。迟缓爱德华氏菌是严重危害包括花鲈在内的诸多水产动物的致病菌,可通过鱼类的消化道、鳃或受伤的表皮侵入鱼体[31]。在花鲈头肾组织中,经Poly (I:C) 和Edw刺激后表达量迅速升高,这与齿舌鲈头肾白细胞在Poly (I:C) 作用后6~24 h上调变化一致[11]。本研究表明,3种刺激物均可诱导花鲈b2m基因在鳃、肠、头肾、脾脏组织中的表达量发生变化,总体上呈上调表达,说明b2m基因可能参与了抗细菌感染和抗病毒感染的过程,但在不同组织中表达量达到峰值的时间点有差异,显示出不同的表达调节状况,推测是由于具有功能上的组织特异性及其免疫效应时间不同所致。总体上迟缓爱德华氏菌对b2m表达的诱导效果要明显强于LPS和Poly (I:C),推测当前剂量下迟缓爱德华氏菌对花鲈免疫系统的激发更强烈。

      本研究克隆了花鲈b2m基因的cDNA全长,b2m基因在花鲈各组织器官中呈组成型表达,推测该基因参与了鱼类抗细菌和抗病毒感染的免疫应答过程,为探究b2m基因参与抗细菌和病毒感染的免疫调节机制及后续功能研究奠定了基础。

参考文献 (31)

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