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基于微卫星标记的图们江大麻哈鱼亲子鉴定技术研究

韩叶 郑伟 康学会 闫春梅 李忠强 刘慧吉 李秀颖 柳鹏 陈伟强

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基于微卫星标记的图们江大麻哈鱼亲子鉴定技术研究

    作者简介: 韩 叶(1988—),女,硕士研究生,研究方向为渔业资源保护。E-mail: yyweixiao@163.com;
    通讯作者: 郑伟, zw0721@sohu.com
  • 中图分类号: S 931

Parentage analysis of chum salmon (Oncorhynchus keta) in Tumen River based on microsatellites

    Corresponding author: Wei ZHENG, zw0721@sohu.com ;
  • CLC number: S 931

  • 摘要: 大麻哈鱼 (Oncorhynchus keta) 是重要的洄游性经济鱼类,在中国分布于黑龙江、乌苏里江、绥芬河和图们江水域。为保护大麻哈鱼种质资源,恢复图们江流域野外种群数量,该研究基于微卫星标记技术,利用10对微卫星标记,对355尾回捕子代和91尾繁殖亲本开展了亲子关系鉴定研究。结果表明,检测等位基因数 (Na) 201个,观测杂合度 (Ho) 为0.617~0.895,平均0.744;期望杂合度 (He) 为0.676~0.909,平均0.824;多态信息含量 (PIC) 为0.628~0.900,平均0.805。利用Cervus 3.0软件计算10个微卫星座位的累积非亲排除率 (CEP) 达99.95%。5个回捕样本与繁殖亲本存在亲子关系,确定为增殖放流的大麻哈鱼。该研究成功利用微卫星标记技术明确回捕大麻哈鱼归属地,为巩固中国鱼源国地位提供有力证据,同时为评估大麻哈鱼的增殖放流效果提供技术支撑。
  • 图 1  微卫星座位OKE-4 (左)、OKE-3 (右)基因分型结果

    Figure 1.  Genotype of the microsatellite loci of OKE-1 (left) and OKE-3 (right) in O. keta

    表 1  10个微卫星标记特征参数

    Table 1.  Characteristic parameters of ten microsatellite loci in O. keta

    位点
    Locus
    等位基因数
    Na
    观测杂合度
    Ho
    期望杂合度
    He
    多态信息含量
    PIC
    Hardy-Weinberg 平衡检测
    HWE
    OKE-1 17 0.814 0.830 0.808 NS
    OKE-2 14 0.713 0.676 0.653 NS
    OKE-3 11 0.711 0.676 0.628 *
    OKE-4 28 0.668 0.909 0.900 ***
    OKE-5 26 0.670 0.887 0.876 ***
    OKE-6 20 0.758 0.860 0.845 ***
    OKE-7 16 0.892 0.872 0.858 ***
    OKE-8 27 0.895 0.893 0.884 ***
    OKE-9 20 0.617 0.866 0.852 ***
    OKE-10 22 0.700 0.770 0.745 ***
    平均 Mean 20.1 0.744 0.824 0.805
    注: NS. 未显著偏离“哈-温”平衡 (P>0.05);*. 显著偏离“哈-温”平衡 (P<0.05);***. 极其显著偏离“哈-温”平衡(P<0.001) Note: NS. No significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05); *. Significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.05); ***. Very significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.001)
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    表 2  非亲排除率和累积非亲排除率检测结果

    Table 2.  Results of non-exclusion probablility (NEP) and combined non-exclusion probability (CEP)

    基因座位
    Locus
    登录号
    GenBank access No.
    非亲排除率
    NEP
    累积非亲排除率
    CEP
    无效等位基因频率
    Frequency of null
    OKE-4 MH619623 0.314 3 0.150 4
    OKE-8 MH619627 0.347 6 0.890 7 –0.005 6
    OKE-5 MH619624 0.367 7 0.959 8 0.134 5
    OKE-7 MH619626 0.410 2 0.983 5 –0.012 5
    OKE-9 MH619628 0.419 1 0.993 1 0.160 4
    OKE-6 MH619625 0.432 1 0.997 0 0.059 3
    OKE-1 MH619620 0.506 1 0.998 5 0.009 9
    OKE-10 MH619629 0.595 0 0.999 1 0.038 7
    OKE-2 MH619621 0.703 6 0.999 3 –0.042 7
    OKE-3 MH619622 0.734 3 0.999 5 –0.028 3
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    表 3  5尾大麻哈鱼亲子鉴定结果

    Table 3.  Paternity test result of five individuals of O. keta collected from Tumen River

    子代编号
    Offspring No.
    采集时间
    Sampling time
    亲本编号
    Parent No
    错配座位数
    Pair loci mismatching
    LOD
    Pair LOD score
    Delta
    Pair top LOD
    自信度95%
    Pair confident 95%
    2017DMH8020172014P5606.526.52*
    2017DMH9820172014P4806.546.54*
    2017DMH9120172014P6401.091.09*
    2018DMH7720182015P9805.625.62*
    2018DMH25920182015P9605.925.92*
    注:*. 在95%自信度下显著 Note: *. Pair LOD score is significant with a 95% confidence interval.
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-02-19
  • 录用日期:  2020-03-17
  • 网络出版日期:  2020-07-02

基于微卫星标记的图们江大麻哈鱼亲子鉴定技术研究

    作者简介:韩 叶(1988—),女,硕士研究生,研究方向为渔业资源保护。E-mail: yyweixiao@163.com
    通讯作者: 郑伟, zw0721@sohu.com
  • 吉林省水产科学研究院,吉林 长春 130000

摘要: 大麻哈鱼 (Oncorhynchus keta) 是重要的洄游性经济鱼类,在中国分布于黑龙江、乌苏里江、绥芬河和图们江水域。为保护大麻哈鱼种质资源,恢复图们江流域野外种群数量,该研究基于微卫星标记技术,利用10对微卫星标记,对355尾回捕子代和91尾繁殖亲本开展了亲子关系鉴定研究。结果表明,检测等位基因数 (Na) 201个,观测杂合度 (Ho) 为0.617~0.895,平均0.744;期望杂合度 (He) 为0.676~0.909,平均0.824;多态信息含量 (PIC) 为0.628~0.900,平均0.805。利用Cervus 3.0软件计算10个微卫星座位的累积非亲排除率 (CEP) 达99.95%。5个回捕样本与繁殖亲本存在亲子关系,确定为增殖放流的大麻哈鱼。该研究成功利用微卫星标记技术明确回捕大麻哈鱼归属地,为巩固中国鱼源国地位提供有力证据,同时为评估大麻哈鱼的增殖放流效果提供技术支撑。

English Abstract

  • 大麻哈鱼 (Oncorhynchus keta) 隶属于鲑形目、鲑科、大麻哈鱼属,广泛分布于北太平洋及沿岸河流[1]。在中国仅分布于黑龙江中上游、乌苏里江、绥芬河及图们江水系[2]。大麻哈鱼是典型的溯河洄游性经济鱼类,幼年在春季降河进入海洋,在海洋中完成生长发育,性成熟后洄游到出生地产卵,终身繁殖一次后死亡[3]。大麻哈鱼洄游路途遥远,过程艰难。近年来,由于人为干预造成的产卵环境破坏,过度开发大麻哈鱼肉产品及鱼子酱,加之洄游通道途径朝鲜,遭到朝鲜渔船肆意捕捞,每年洄游图们江的大麻哈鱼数量仅约4 000尾,种群数量已下降到濒临灭绝的程度[4]。增殖放流是改善野外资源现状,恢复渔业资源产量最有效的途径,在世界各国普遍开展[5]。吉林省渔业局每年开展增殖放流活动,向图们江支流珲春河、密江河放流40万~50万尾鱼苗,以增加图们江资源量。评估鱼类增殖放流效果的主要方法是统计个体标记和回捕率分析法,如剪鳍法、体外挂牌、金属线标 (Coded wire tag, CWT)和注射荧光染料标记 (Visible implant elastomer, VIE) 等[6-9]。这些标记方法易于发现和回收,但对鱼体伤害大、标记留存时间短[10],不适合标记洄游产卵的大麻哈鱼。随着分子生物学的不断发展,基于DNA序列的微卫星标记因其多态性信息丰富、共显性遗传、便于检测等优点,在水生动物亲缘关系鉴定和遗传多样性分析研究中被广泛应用[11-16]。成为为等[17]使用11对微卫星标记对长江中上游采集的胭脂鱼 (Myxocyprinus asiaticus) 进行放流效果评估,结果显示65尾回捕子代中11尾与亲本存在亲子关系;冯晓婷等[18]利用10个微卫星标记对长江江苏段鳙 (Aristichthys nobilis) 进行放流效果评估,结果显示687尾回捕子代中42尾与亲本存在亲子关系;刘胜男等[5]通过9对微卫星标记对北部湾长毛对虾 (Penaeus penicillatus) 开展亲子鉴定,结果表明517尾回捕对虾中202尾与亲本存在亲子关系。已报道的团头鲂 (Megalobrama amblyccphala)、圆口铜鱼 (Coreius guichenoti)、唇䱻 (Hemibarbus labeo)等水产动物均已开展基于微卫星标记的亲子鉴定分析研究[19-21]

    目前国内学者对大麻哈鱼的研究主要集中在生物学特征、繁殖力、洄游群体结构等方面[22-27],亲缘关系鉴定和放流效果评估方面却鲜有报道。本研究利用自主开发的10对微卫星标记[28],以图们江大麻哈鱼种群为研究对象,开展基于微卫星标记的亲子鉴定技术研究,明确增殖放流大麻哈鱼归属地,并探讨微卫星标记技术在亲子关系鉴定中的可行性,为大麻哈鱼种质资源保护和增殖放流效果评估提供技术支持。

    • 人工繁殖期间,在吉林省延边州和龙市青龙渔场开展大麻哈鱼人工繁育。繁殖亲鱼雌雄比例约为8∶3,繁育后取雌性亲鱼背部肌肉组织,保存于无水乙醇中。2014年和2015年分别采集雌性亲鱼62尾和29尾。所有后代饲养至7~10 cm,选取苗种活力好的幼鱼于珲春河放流,放流数量约20万~40万尾。2017年和2018年10月在延边州珲春市防川图们江河口分别采集回捕子代28尾和327尾,剪取鱼鳞组织,保存于无水乙醇中。

    • 使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒 (北京天根生物有限公司) 提取基因组DNA,其中鱼鳞组织需经液氮充分研磨。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后用于PCR扩增。利用10对微卫星标记合成荧光引物 (5'FAM-F),终浓度10 µmol·L–1,避光保存。PCR扩增体系和程序为:2×Taq PCR mix 12.5 μL (北京鼎国生物技术有限公司),正反向引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至25 μL。94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,56~61 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,重复35个循环;72 ℃充分延伸5 min。PCR扩增条带清晰产物经ABI 3730 XL sequencer自动测序仪 (ROX-500 standard) 测序,使用Genemapper 4.0[29]软件获取等位基因大小。

    • 大麻哈鱼为3年溯河洄游性鱼类,通过比对2014年繁育亲本与2017年回捕子代、2015年繁育亲本与2018年回捕子代两组实验数据进行亲子关系鉴定。利用Cervus 3.0[30]软件分别计算各个位点的等位基因数 (Na)、观测杂合度 (Ho)、期望杂合度 (He)、多态信息含量 (PIC)、无效等位基因频率 (Fnull)、Hardy-Weinberg平衡、非亲排除率 (NEP) 和累积非亲排除率 (CEP) 等参数;以亲本双盲建模模拟运行10 000次检测临界最大似然比值 (LOD score),在95%置信水平内,子代与亲代候选者之间的LOD值越大,亲本候选者可能性越大 (Most-likely parents)[31]。在无位点错配的条件下,认定LOD值最高的候选亲本为遗传学亲本。

    • 10对微卫星引物均获得稳定的PCR扩增产物,共检测201个等位基因。各位点等位基因数在11~28分布范围内,平均为20.1 (表1)。其中等位基因数最多的是OKE-4座位,含有28个等位基因,等位基因数最少的是OKE-3座位,含有11个,测序图见图1Ho介于0.617~0.895,平均为0.744;He介于0.676~0.909,平均为0.824;PIC介于0.628~0.900,平均为0.805。10个基因座位经Bonferroni校正后,座位OKE-1、OKE-2符合“哈温定律”,座位OKE-3显著偏离,其他座位均极显著偏离“哈温定律”,未见无效等位基因频率对鉴定结果产生明显影响。在95%置信区间内,每个位点的NEP介于31.43%~73.43%,10个位点的CEP达到99.95%。各位点NEP和CEP 结果见表2

      位点
      Locus
      等位基因数
      Na
      观测杂合度
      Ho
      期望杂合度
      He
      多态信息含量
      PIC
      Hardy-Weinberg 平衡检测
      HWE
      OKE-1 17 0.814 0.830 0.808 NS
      OKE-2 14 0.713 0.676 0.653 NS
      OKE-3 11 0.711 0.676 0.628 *
      OKE-4 28 0.668 0.909 0.900 ***
      OKE-5 26 0.670 0.887 0.876 ***
      OKE-6 20 0.758 0.860 0.845 ***
      OKE-7 16 0.892 0.872 0.858 ***
      OKE-8 27 0.895 0.893 0.884 ***
      OKE-9 20 0.617 0.866 0.852 ***
      OKE-10 22 0.700 0.770 0.745 ***
      平均 Mean 20.1 0.744 0.824 0.805
      注: NS. 未显著偏离“哈-温”平衡 (P>0.05);*. 显著偏离“哈-温”平衡 (P<0.05);***. 极其显著偏离“哈-温”平衡(P<0.001) Note: NS. No significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05); *. Significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.05); ***. Very significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.001)

      表 1  10个微卫星标记特征参数

      Table 1.  Characteristic parameters of ten microsatellite loci in O. keta

      图  1  微卫星座位OKE-4 (左)、OKE-3 (右)基因分型结果

      Figure 1.  Genotype of the microsatellite loci of OKE-1 (left) and OKE-3 (right) in O. keta

      基因座位
      Locus
      登录号
      GenBank access No.
      非亲排除率
      NEP
      累积非亲排除率
      CEP
      无效等位基因频率
      Frequency of null
      OKE-4 MH619623 0.314 3 0.150 4
      OKE-8 MH619627 0.347 6 0.890 7 –0.005 6
      OKE-5 MH619624 0.367 7 0.959 8 0.134 5
      OKE-7 MH619626 0.410 2 0.983 5 –0.012 5
      OKE-9 MH619628 0.419 1 0.993 1 0.160 4
      OKE-6 MH619625 0.432 1 0.997 0 0.059 3
      OKE-1 MH619620 0.506 1 0.998 5 0.009 9
      OKE-10 MH619629 0.595 0 0.999 1 0.038 7
      OKE-2 MH619621 0.703 6 0.999 3 –0.042 7
      OKE-3 MH619622 0.734 3 0.999 5 –0.028 3

      表 2  非亲排除率和累积非亲排除率检测结果

      Table 2.  Results of non-exclusion probablility (NEP) and combined non-exclusion probability (CEP)

    • 利用Cervus3.0软件对91尾繁殖亲本与355尾回捕子代进行亲子关系鉴定,10对微卫星标记的CEP达到99.95%。共有25尾回捕子代在95%置信区间内LOD大于0,其中5尾回捕子代与候选亲本之间基因座位完全匹配 (表3),16尾子代与候选亲本存在1个基因座位错配,4尾子代与候选亲本存在2个基因座位错配。据此认定这5尾回捕子代是来自繁殖亲本的放流个体,其中3尾为2017年捕获,2尾为2018年捕获 。

      子代编号
      Offspring No.
      采集时间
      Sampling time
      亲本编号
      Parent No
      错配座位数
      Pair loci mismatching
      LOD
      Pair LOD score
      Delta
      Pair top LOD
      自信度95%
      Pair confident 95%
      2017DMH8020172014P5606.526.52*
      2017DMH9820172014P4806.546.54*
      2017DMH9120172014P6401.091.09*
      2018DMH7720182015P9805.625.62*
      2018DMH25920182015P9605.925.92*
      注:*. 在95%自信度下显著 Note: *. Pair LOD score is significant with a 95% confidence interval.

      表 3  5尾大麻哈鱼亲子鉴定结果

      Table 3.  Paternity test result of five individuals of O. keta collected from Tumen River

    • 微卫星标记相比传统的同工酶标记等,具有严格遵循孟德尔遗传定律、准确度高、稳定性好等优点[32]。参数中的有效等位基因个数、PIC、杂合度是遗传多样性评估的3个重要指标,数值越高,表明该群体的遗传多样性越高。Botstein等[33]提出过PIC的划分标准,PIC≤0.25,表现低度多态性;PIC介于0.25~0.50,表现中度多态性;PIC>0.50,表现高度多态性。本研究中10个微卫星位点均表现高度多态性 (表1),平均为0.805,体现较高的遗传多样性水平,满足大麻哈鱼亲子鉴定要求。Ho平均值为0.744,He平均值为0.824,表明10个微卫星位点较好地反映出种群内丰富的遗传多样性。NEP和CEP是重要的亲子鉴定指标,各个位点的NEP与PIC呈明显反比关系,与其他研究结果一致[17-18]。随着微卫星标记数量的增加,CEP逐步提升,证实微卫星数量是影响CEP的因素[34]。有学者认为在进行亲子鉴定分析时,CEP至少应达到99%[35],当CEP达到99%~99.73%,存在亲子关系的可能极大;当CEP大于99.73%,可认定存在亲子关系[36]。本研究中7个微卫星座位的CEP达到99.85%,10个微卫星座位高达99.95% (表2),进一步证明这些微卫星标记用于图们江大麻哈鱼种群亲子鉴定的可行性。

    • 亲子鉴定最常采用的方法为似然值 (LOD) 法。LOD小于0时,候选亲本被排除其作为真实亲本的可能性;LOD等于0时,认定候选亲本与群体中其他个体成为真实亲本的可能性相同。确定亲子关系,LOD必须大于0,95%置信区间内所有位点无错配,该候选亲本是真实亲本的可能性最大。通过Cervus软件显示,25尾回捕个体在95%置信区间内LOD大于0,其中5尾个体与繁殖亲本间10个基因座位完全匹配,另外16尾子代与亲代间存在1个座位错配,4尾子代与亲本存在2个座位错配。有学者认为,在微卫星位点匹配方面,若子代与候选亲本位点完全匹配,可认定其为遗传学亲本,最多可接受有1个位点出现错配;若出现2个或2个以上的错配位点,认定该候选亲本不是子代的遗传学亲本[37]。经计算只错配1个位点的CEP均达99.73%以上 (未在表中列出),认为其存在亲子关系的可能性极大。本研究确定5尾放流个体是繁殖亲鱼的子代,占总回捕数的1.41%。每年秋季在图们江口难以见到洄游产卵的大麻哈鱼,由于数量稀少,捕捞工作难度大,2015年获得的候选亲本仅29尾,因留存和采集的样本有限导致本次鉴定结果数量偏少。

      国内学者对大麻哈鱼的研究多集中在黑龙江流域和绥芬河,对吉林省图们江水系大麻哈鱼种群研究相对较少。王继隆等[6]采用剪脂鳍的标记方法开展绥芬河大麻哈鱼种群增殖放流效果评估研究,2012—2017年间采集的462尾回捕样本中有41尾标记个体,计算每年增殖放流回捕率为0.295%。本研究系国内首次开展大麻哈鱼亲子鉴定研究,推算的回捕率结果略高于王继隆等[6]的研究结果,可能因为物理标记法 (注射VIE荧光染剂法、剪鳍法) 具有局限性,会随时间推移发生变化 (荧光染料褪色、鱼鳍再生),致使这些标记不易被观察,迄今为止在图们江流域尚未见有明显标记的渔获物。20世纪初,图们江大麻哈鱼产量可达10万余尾,吉林珲春一直流传“踩着鱼背过河,手拿棒子打鱼”的佳话,可见鱼产丰富,如今产量不足十分之一。亲子鉴定是检测增殖放流效果的重要措施,根据鉴定结果,认为图们江流域洄游的大麻哈鱼种群中存在一定比例的放流个体,说明增殖放流对补充其种群数量起到了良好作用。证明微卫星标记技术在大麻哈鱼亲子鉴定中具有可行性,今后可应用该技术指导增殖放流效果评估研究,准确判定增殖放流对自然群体的贡献率。

    • 图们江是我国四个大麻哈鱼种群分布地之一。《联合国海洋法》第六十六条规定:“产卵种群源自其河流的国家对于这种种群应有主要利益和责任”。图们江是我国与朝鲜和俄罗斯的界河,是我国进入日本海的通道,图们江临岸主要为朝鲜和俄罗斯的专属经济区,我国虽享受海洋渔业权利,但由于洄游大麻哈鱼数量少,我国海洋捕捞份额受限。虽然加大了图们江增殖放流力度,大麻哈鱼资源有所恢复,但仍处于低位水平。为争取我国海洋捕捞份额,明确洄游大麻哈鱼的归属问题,巩固我国大麻哈鱼鱼源国地位,仍需做好大麻哈鱼的亲子鉴定研究工作。有研究表明,渔业增殖放流可能对自然群体产生负面影响[38],因此必须建立科学的大麻哈鱼种质资源保护机制,确保繁殖亲本来源,降低人工增殖放流对野外种群遗传多样性的影响。

      本研究初步建立了图们江流域大麻哈鱼亲子鉴定以及增殖放流效果评估系统,今后将持续丰富繁殖亲本遗传信息,追踪洄游放流个体,为图们江大麻哈鱼种群增殖放流效果评估和放流策略提供理论依据和技术手段。

参考文献 (38)

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