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石菖蒲挥发油和水溶性氮酮对鱼用麻醉剂的促皮渗透效果研究

王文豪 董宏标 孙彩云 段亚飞 李华 刘青松 张家松 曾祥兵

引用本文:
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石菖蒲挥发油和水溶性氮酮对鱼用麻醉剂的促皮渗透效果研究

    作者简介: 王文豪 (1994—),男,硕士研究生,研究方向为鱼类生理生态学。E-mail: wanghao5889@126.com;
    通讯作者: 张家松, jiasongzhang@hotmail.com
  • 中图分类号: S 948

Study on transdermal penetration effect of A. tatarinowii essential oil and water soluble azone to fish anesthetics

    Corresponding author: Jiasong ZHANG, jiasongzhang@hotmail.com ;
  • CLC number: S 948

  • 摘要: 文章研究了石菖蒲 (Acorus tatarinowii) 挥发油和水溶性氮酮2种常见透皮促进剂 (PE) 的4种不同质量分数 (1%、4%、7%、10%和1%、3%、5%、10%) 对中国花鲈 (Lateolabrax maculatus) 幼鱼药浴吸收MS-222和丁香酚的促透效果。结果显示:1) 2种PE可显著减少入麻和复苏时间,并降低丁香酚或MS-222的使用剂量以达到相似的麻醉效果;2) 2种PE的促透效果随浓度升高先增强后减弱;3) 石菖蒲挥发油与水溶性氮酮对丁香酚或MS-222的最佳促透质量分数分别为7%和3%。分析鳃组织抗氧化指标发现:1) 丁香酚和MS-222浸泡对中国花鲈鳃组织造成一定程度的氧化应激,表现为鳃组织中过氧化物酶 (POD)、超氧化物歧化酶 (SOD)、氧化氢酶 (CAT) 活性和谷胱甘肽 (GSH)、氧化氢酶 (CAT) 浓度显著 (P<0.05) 升高;2) 协同使用PE,可减少麻醉剂用量,进而降低鳃组织氧化应激,表现为麻醉协同组鳃中SOD、CAT活性和MDA、GSH浓度显著 (P<0.05) 低于麻醉对照组。
  • 图 1  中国花鲈达到镇静、麻醉和完全复苏的时间 (n=10)

    Figure 1.  Time to achieve sedation, anesthesia and complete resuscitation of L. maculatus (n=10)

    图 2  中国花鲈达到镇静、麻醉和完全复苏的时间 (n=10)

    Figure 2.  Time to achieve sedation, anesthesia and complete resuscitation of L. maculatus (n=10)

    图 3  鳃组织抗氧化指标 (n=5)

    Figure 3.  Antioxidant indices of gill tissue (n=5)

    表 1  麻醉与复苏阶段鱼类行为特征

    Table 1.  Behavioral characteristics of fish during anaesthesia and recovery stages

    麻醉与复苏阶段
    Anaesthesia and recovery stages
    行为特征
    Behavior characteristics
    备注
    Remarks
    正常
    Normal
    对外界刺激有反应;鳃盖张合和肌肉收缩正常
    麻醉阶段
    Anaesthesia stage
    深度镇静
    Deep sedation
    对强刺激有反应;鳃盖张合频率减少;平衡正常 用于一般运输
    麻醉
    Anesthesia
    完全丧失肌肉张力和平衡;鳃盖张合频率慢 最佳操作期
    复苏阶段
    Recovery stages
    行为完全恢复
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-13
  • 录用日期:  2020-04-07
  • 网络出版日期:  2020-05-26

石菖蒲挥发油和水溶性氮酮对鱼用麻醉剂的促皮渗透效果研究

    作者简介:王文豪 (1994—),男,硕士研究生,研究方向为鱼类生理生态学。E-mail: wanghao5889@126.com
    通讯作者: 张家松, jiasongzhang@hotmail.com
  • 1. 水产科学国家级实验教学示范中心 (上海海洋大学),上海 201306
  • 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300
  • 3. 三亚热带水产研究院,海南 三亚 572000

摘要: 文章研究了石菖蒲 (Acorus tatarinowii) 挥发油和水溶性氮酮2种常见透皮促进剂 (PE) 的4种不同质量分数 (1%、4%、7%、10%和1%、3%、5%、10%) 对中国花鲈 (Lateolabrax maculatus) 幼鱼药浴吸收MS-222和丁香酚的促透效果。结果显示:1) 2种PE可显著减少入麻和复苏时间,并降低丁香酚或MS-222的使用剂量以达到相似的麻醉效果;2) 2种PE的促透效果随浓度升高先增强后减弱;3) 石菖蒲挥发油与水溶性氮酮对丁香酚或MS-222的最佳促透质量分数分别为7%和3%。分析鳃组织抗氧化指标发现:1) 丁香酚和MS-222浸泡对中国花鲈鳃组织造成一定程度的氧化应激,表现为鳃组织中过氧化物酶 (POD)、超氧化物歧化酶 (SOD)、氧化氢酶 (CAT) 活性和谷胱甘肽 (GSH)、氧化氢酶 (CAT) 浓度显著 (P<0.05) 升高;2) 协同使用PE,可减少麻醉剂用量,进而降低鳃组织氧化应激,表现为麻醉协同组鳃中SOD、CAT活性和MDA、GSH浓度显著 (P<0.05) 低于麻醉对照组。

English Abstract

  • 透皮促进剂 (Penetration enhancers,PE) 是指通过改变角质层的屏障功能[1],以达到增加药物经皮肤到达体内的通透率[2]和减少给药次数和剂量[3]的物质,使用方式通常是将PE与药物混匀,均匀涂抹到皮表组织或喷洒到黏膜组织[45],或通过药浴给药[67]。常见的PE有石菖蒲 (Acorus tatarinowii) 挥发油和水溶性氮酮。石菖蒲的主要功能成分为挥发油,主要活性成分为细辛醚类[8],具有抗氧化、抗血栓、抗抑郁和药物促透等作用,由于其促透效果卓著而备受关注[911]。水溶性氮酮为一种合成的PE,因其促透率高、副作用小,已被广泛应用于医药、农业和日化行业。水产养殖种苗捕捞、运输过程中,通常使用安全可靠的麻醉剂。丁香酚和间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 (三卡因、MS-222) 是2种常用的麻醉剂[1213],但因其存在安全隐患而被多次报道[1419]。目前,PE在畜禽中使用较多,而在水产中研究甚少。本文以中国花鲈 (Lateolabrax maculatus) 幼鱼为实验对象,结合鳃组织的抗氧化指标分析,评价了石菖蒲挥发油和水溶性氮酮对丁香酚或MS-222的促透效果,明确最佳促透剂含量,以期为鱼类麻醉应激的防护和PE在水产上的应用提供参考。

    • 中国花鲈 (Lateolabrax maculatus) 幼鱼购自广东省珠海市某育苗厂。运输至实验室后先经1 g·m−3的碘制剂消毒,再置于室内水泥池 (3 m×4 m×1 m) 暂养2周以上,暂养密度为10尾·m−3。暂养期间,投喂海水鱼配合饲料 (广州海龙饲料有限公司),每日早晚各1次,投喂质量为鱼体质量的 (3±1)%。日换水1次,换水率30%。水温 (28±0.5)℃,溶解氧始终高于6 mg·L−1,pH 7.6±0.2,自然光周期。实验所用石菖蒲挥发油 (挥发油≥99%) 和水溶性氮酮 (纯度≥99%) 均购自湖北省康纯香料有限公司;丁香酚 (纯度≥98%) 购于北京迈瑞达科技有限公司;MS-222 (纯度≥99%) 购于青岛文鼎商贸有限公司。

    • MS-222与碳酸氢钠以质量比1∶1溶于纯水,配制成母液,为防止光分解,保存于棕色玻璃瓶中备用[20];以体积比1∶10将丁香酚溶于乙醇,制成母液备用 (MS-222和丁香酚各制备9份母液)。参照白一岑等[11]方法,将石菖蒲挥发油和水溶性氮酮以1∶10体积比溶于乙醇,向配制好的MS-222和丁香酚母液中分别加入质量分数为1%、4%、7%和10%的石菖蒲挥发油和1%、3%、5%和10%的水溶性氮酮 (PE与麻醉剂质量比) 配成促透麻醉液,同时设置乙醇为对照组。参照Wang等[14]的分类标准和麻醉剂量,将麻醉诱导过程简化为2个阶段,将复苏过程简化为1个阶段 (表1);选用10 mg·L−1丁香酚或50 mg·L−1MS-222对幼鱼进行麻醉 (此浓度的MS-222或丁香酚可诱导至麻醉阶段,但不能诱导至深度麻醉阶段)。平均体质量为 (98.1±7.3) g的幼鱼停食24 h后用于麻醉实验。先向白色塑料桶中加入10 L曝气2 d以上的自来水;然后加入麻醉液或促透麻醉液,使丁香酚或MS-222质量浓度分别达到10 mg·L−1或50 mg·L−1;最后将幼鱼置于麻醉桶中,记录每条幼鱼进入镇静和麻醉状态所用时间 (每个处理组10次重复,每尾鱼单独观察并只使用1次)。麻醉后幼鱼被转移至无麻醉液的复苏桶中进行复苏,记录复苏所用时间。此外,将幼鱼分别置于5 mg·L−1石菖蒲挥发油和5 mg·L−1水溶性氮酮溶液 (本实验用到最大剂量的PE),观察幼鱼能否进入镇静状态或麻醉状态,以排除2种促皮渗透剂是否对幼鱼具有麻醉效果。

      麻醉与复苏阶段
      Anaesthesia and recovery stages
      行为特征
      Behavior characteristics
      备注
      Remarks
      正常
      Normal
      对外界刺激有反应;鳃盖张合和肌肉收缩正常
      麻醉阶段
      Anaesthesia stage
      深度镇静
      Deep sedation
      对强刺激有反应;鳃盖张合频率减少;平衡正常 用于一般运输
      麻醉
      Anesthesia
      完全丧失肌肉张力和平衡;鳃盖张合频率慢 最佳操作期
      复苏阶段
      Recovery stages
      行为完全恢复

      表 1  麻醉与复苏阶段鱼类行为特征

      Table 1.  Behavioral characteristics of fish during anaesthesia and recovery stages

    • 根据促透实验得出质量分数为7%石菖蒲挥发油和3%水溶性氮酮促进麻醉效果最佳,将8 mg·L−1 丁香酚或40 mg·L−1MS-222与质量分数为7%石菖蒲挥发油或3%水溶性氮酮混合,同时设置无促透剂的对照组。进行麻醉实验,记录镇静、麻醉和复苏所用时间。

    • 设置对照组 (AC)、10 mg·L−1丁香酚 (EC)、8 mg·L−1丁香酚+7%石菖蒲挥发油 (ES)、8 mg·L−1 丁香酚+4%水溶性氮酮 (ED)、50 mg·L−1MS-222 (MC)、40 mg·L−1 MS-222+7%石菖蒲挥发油 (MS) 和40 mg·L−1 MS-222+4%水溶性氮酮 (MD) 共7个处理组。将幼鱼按照不同组处理后进行复苏,复苏后6 h [ 0~1 h内丁香酚在罗非鱼 (Oreochromis spp) 肝脏中的浓度逐渐升高,第1小时达到峰值,之后逐渐降低[21];MS-222在白斑角鲨 (Squalus acanthias) 血液中的半衰期约为1.5~4 h [22],考虑到药物在不同动物中的代谢动力学未必相同,故选择在复苏后6 h取样],采集鳃组织进行抗氧化指标测定。取4 ℃无菌生理盐水先对鳃组织进行冲洗,再9倍体积的用4 ℃无菌生理盐水 (m/V) 将鳃组织匀浆,在低温离心机中以6 000 g的转速离心20 min,收集上清液备用。酶活检测所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,相应操作参照说明书进行。采用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度 (以牛血清为基准);采用黄呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶 (SOD) 活性 (组织中每毫克蛋白在0.24 mL反应液中,抑制率达50%时所对应的酶量定为1个酶活力单位);采用比色法测定过氧化物酶 (POD) 活性 (在37 ℃条件下,每毫升血清每分钟催化1 μg底物的酶量定义为1个酶活力单位);采用紫外法测定过氧化氢酶 (CAT) 活性 [组织中每毫克蛋白每秒分解1 μmol的过氧化氢 (H2O2)的量为1个酶活力单位];采用比色法测定谷胱甘肽 (GSH) 浓度 (二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应生成黄色化合物,可进行比色定量测定);采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛 (MDA) 浓度 (过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合,形成红色产物,进行定量测定)。

    • 所有数据均以“平均数±标准差 ($\overline X$±SD)”表示。使用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计学分析。在单因素方差分析的基础上,采用Duncan多重比较法进行分析。显著性水平设定为P <0.05。使用ORIGIN 8.0软件对实验数据进行绘图。

    • 随着2种PE浓度的增加,幼鱼进入镇静阶段和麻醉阶段的时间呈现先减少后增加的趋势 (质量分数为7%的石菖蒲挥发油和3%的水溶性氮酮达到峰值),完全复苏的时间同样呈现先减少后增加的趋势 (质量分数为7%的石菖蒲挥发油和3%的水溶性氮酮达到峰值,图1)。将幼鱼置于5 mg·L−1石菖蒲挥发油、5 mg·L−1水溶性氮酮溶液,均未观察到镇静与麻醉状态。

      图  1  中国花鲈达到镇静、麻醉和完全复苏的时间 (n=10)

      Figure 1.  Time to achieve sedation, anesthesia and complete resuscitation of L. maculatus (n=10)

    • 向低剂量麻醉剂 (麻醉剂减量20%) 中加入质量分数为7%的石菖蒲挥发油或3%的水溶性氮酮后,可达到与高剂量麻醉剂相似的麻醉效果 (图1)。低剂量麻醉剂加入质量分数为7%的石菖蒲挥发油后,进入麻醉和复苏的时间较其对照组显著降低 (图1-ab)。低剂量麻醉剂加入质量分数为3%的水溶性氮酮后,复苏时间较其对照组显著降低 (图1-cd)。低剂量麻醉剂不加PE,仅进入镇静阶段,无法进入麻醉阶段 (图2)。

      图  2  中国花鲈达到镇静、麻醉和完全复苏的时间 (n=10)

      Figure 2.  Time to achieve sedation, anesthesia and complete resuscitation of L. maculatus (n=10)

    • 对鳃组织抗氧化指标分析发现,EC和MC组较AC组POD、SOD、CAT活性和MDA、GSH浓度显著升高 (P<0.05);EC和MC组分别较ES和MS组POD、SOD、CAT活性和MDA、GSH浓度显著升高 (除EC组的POD活性,图3-aP<0.05);MC组较MD组SOD活性和MDA浓度显著升高 (P<0.05);ED组较ES组SOD、CAT活性和MDA、GSH出现升高,但不显著 (P>0.05);MD组较MS组CAT活性显著升高 (P<0.05),POD、SOD活性和MDA、GSH浓度也出现升高,但不显著 (P>0.05,图3)。

      图  3  鳃组织抗氧化指标 (n=5)

      Figure 3.  Antioxidant indices of gill tissue (n=5)

    • 本研究将幼鱼单独置于2种PE溶液中均未观察到镇静和麻醉状态,排除了该浓度石菖蒲挥发油和水溶性氮酮的麻醉效应。研究发现,麻醉剂加入2种PE,均能缩短花鲈镇静、麻醉和复苏的时间,这可能是石菖蒲挥发油和水溶性氮酮对2种麻醉剂的吸收具有促进作用,或是麻醉剂和PE具有协同作用,亦或是PE对麻醉效果具有加成作用。

      质量分数为7%的石菖蒲和3%的氮酮促透效果最佳,且促透倍数相似,该结果与王建新和郭力 [23]、白一岑等[11]的相似。王建新和郭力[23]研究表明,质量分数为3%的水溶性氮酮对如意巴布剂能达到最大促透效果,浓度过低或过高促透效果出现减弱,表明PE并非浓度越高效果越好。本研究中,随着2种PE浓度增加,麻醉剂的麻醉效果呈先增强后减弱的趋势,这一结果间接说明PE对2种麻醉剂具有促透效果 (若无促透效果,随PE浓度升高,麻醉剂的麻醉效果不会出现减弱),但不排除存在协同和加成作用。目前,PE增效方式暂不清晰,未来可根据麻醉剂在体内的浓度进行更深入的研究。

    • 本研究显示,8 mg·L−1的丁香酚和40 mg·L−1的MS-222不能使幼鱼进入麻醉状态,加入质量分数为7%的石菖蒲挥发油或3%的水溶性氮酮后,幼鱼能顺利进入麻醉状态 (图2),并且与10 mg·L−1丁香酚和50 mg·L−1MS-222的麻醉效果相似 (图1),表明通过向麻醉剂加入PE可以减少麻醉剂使用剂量。这可能是由于PE改变了细胞脂质双分子层结构,提高了麻醉剂的通透率和吸收速率,从而降低了对麻醉剂的需求。杨晓春等[3]报道PE能减少给药剂量,这一结论与本研究结果一致。此外,有研究提出PE可增加经皮到达体内药物的有效治疗浓度[24]。因此,通过向麻醉剂中加入PE,降低麻醉剂使用剂量可行。

    • 鳃是参与呼吸、酸碱平衡、离子平衡、含氮废物排泄、渗透调节等多功能的组织[25-26],也被认为是衡量水质的生物指标[27-28],是鱼体与外界水环境互作的重要通道。此外,鳃也是吸收麻醉剂的重要器官。当细胞受到氧化应激时,SOD和CAT是第一道抗氧化防线。SOD和CAT将超氧化物转化为水 (H2O) 和氧气 (O2),消除了自由基的不利影响[29-30],在此过程中POD调节H2O2的水平[31]。因此,POD、SOD和CAT活性是衡量细胞抗氧化能力的关键标志物[32-33]。Ma等[34]研究发现将鲤 (Cyprinus carpio) 暴露于草甘膦后,鳃组织中的SOD和CAT活性升高;姜会民[35]研究也发现,鲤暴露于低剂量氯化汞 (HgCl2) POD活性出现升高。GSH是细胞中重要的抗氧化剂,可以中和自由基或氧化剂,从而对抗过氧化损伤[36-37];MDA是脂质氧化损伤的重要生物标志物[38-39]。本研究中,2种麻醉对照组较乙醇对照组GSH和MDA浓度显著升高 (P<0.05)。Jiao等[26]发现将鲤暴露于毒死婢后,鳃组织中GSH和MDA浓度显著增加。这可能是MS-222和丁香酚对幼鱼的鳃细胞造成了氧化应激,导致鳃细胞抗氧化酶活性和抗氧化剂浓度升高。MS-222和丁香酚造成的麻醉应激是否会对鳃细胞造成损伤,还有待进一步研究。此外,2种麻醉对照组较促透麻醉组的抗氧化物显著上升 (P<0.05),这可能是通过使用PE减少了MS-222或丁香酚的使用剂量,降低了鳃组织所接触麻醉剂浓度,进而减轻了MS-222或丁香酚对鳃组织造成的氧化应激。因此,通过PE降低麻醉剂的使用剂量来减少麻醉剂氧化应激可行。

      石菖蒲挥发油和水溶性氮酮对丁香酚和MS-222有明显的促麻醉效果,并能缩短中国花鲈入麻时间和复苏时间,但石菖蒲挥发油和水溶性氮酮用于水产品的食品安全性尚有待论证。

参考文献 (39)

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