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超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖及其抗氧化活性的研究

黄海潮 王锦旭 潘创 杨贤庆 戚勃 李来好 赵永强

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超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖及其抗氧化活性的研究

    作者简介: 黄海潮 (1995—),女,硕士研究生,从事海洋藻类功能因子生物活性研究。E-mail: 1798721042@qq.com;
    通讯作者: 杨贤庆, yxqgd@163.com
  • 中图分类号: S 985.4+2;O 629.12

Degradation of Porphyra haitanensis polysaccharide by ultrasonic assisted hydrogen peroxide method and its antioxidant activity analysis

    Corresponding author: Xianqing YANG, yxqgd@163.com ;
  • CLC number: S 985.4+2;O 629.12

  • 摘要: 该试验比较了超声波法、过氧化氢法、超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜 (Porphyra haitanensis) 多糖的效果,最后以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 自由基清除率为指标,通过单因素和正交试验优化了超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖的工艺。对比了降解前后多糖的抗氧化活性,并分析了其与分子量、结构特征及理化性质等的相关性。结果表明,在过氧化氢体积分数10%、温度65 ℃、超声波辅助2.5 h条件下,该多糖降解前后DPPH自由基清除率的半抑制浓度 (Half maximal inhibitory concentration, IC50) 由9.37 mg·mL−1降为1.71 mg·mL−1;凝胶渗透色谱结果显示分子量由大于670 kD降为235 835 D;傅里叶红外光谱表明多糖特征吸收峰依旧存在;高效液相色谱分析发现单糖组成大致相同,糖醛酸质量分数有所降低;理化性质显示硫酸基质量分数增高,3,6-内醚半乳糖质量分数明显降低。因而超声波辅助过氧化氢法可较好地降解坛紫菜多糖,并可改善理化性质及结构特征进而增强抗氧化活性,为低分子量多糖的制备及构效关系分析提供依据。
  • 图 1  多糖质量浓度、过氧化氢体积分数、温度、时间对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼清除率的影响

    Figure 1.  Effect of polysaccharide concentration, hydrogen peroxide volume fraction, temperature and time on DPPH scavenging rate

    图 2  坛紫菜多糖和降解后多糖、维生素C对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除效果的影响

    Figure 2.  Effects of PP, LPP and Vc on DPPH scavenging rate

    图 3  坛紫菜多糖和降解后多糖的凝胶渗透色谱图

    Figure 3.  GPC chromatography of PP and LPP

    图 4  坛紫菜多糖和降解后多糖的红外光谱图

    Figure 4.  FT-IR of PP and LPP

    图 5  标准单糖及坛紫菜多糖和降解后多糖的液相色谱图

    Figure 5.  HPLC of standard monosaccharides, PP and LPP

    表 1  单因素试验因素及水平表

    Table 1.  Single factor design for the experiment

    因素
    Factor
    水平
    Level
    多糖质量浓度
    Concentration of polysaccharide/(mg·mL−1)
    2.5、5.0、7.5、10.0、12.5
    过氧化氢体积比 Volume ratio/(mL·mL−1) 4%、6%、8%、10%、12%
    反应温度 Reaction temperature/℃ 35、45、55、65、75
    反应时间 Reaction time/h 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5
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    表 2  正交试验因素及水平表

    Table 2.  Factors and levels used in orthogonal experiment

    水平 Level123
    因素
    Factor
    (A) 多糖浓度
    Concentration of polysaccharide/(mg·mL−1)
    2.5 5.0 7.5
    (B) 反应温度
    Reaction temperature/℃
    55 65 75
    (C) 过氧化氢体积比
    Volume ratio/(mL·mL−1)
    6% 8% 10%
    (D) 反应时间
    Reaction time/h
    1.5 2.0 2.5
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    表 3  3种降解方法的抗氧化作用和降解能力

    Table 3.  Antioxidant activity and degradation capacity of the three degradation methods

    降解方法
    Degradation method
    对DPPH清除率
    DPPH scavenging rate/%
    得率
    Yield/%
    GPC保留时间
    Retention time/min
    分子量Mp
    Molecular mass/D
    超声波法 Ultrasonic method 28.21±0.63b 86.08±4.13a 14.93 >670 000
    过氧化氢法 Hydrogen peroxide method 30.05±0.36b 75.92±2.37b 14.97 602 661
    超声波辅助过氧化氢法
    Ultrasonic assisted hydrogen peroxide method
    48.56±1.51a 65.04±2.56c 15.20 402 065
    注:同列不同上标字母表示组间差异性显著 (P<0.05),表 6同此 Note: Different superscript letters in the same column indicated significant difference between groups (P<0.05); the same case in Tables 6
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    表 4  正交试验设计及结果

    Table 4.  Orthogonal array design and results

    序号
    No.
    因素
    Factor
    DPPH清除率
    DPPH scavenging rate/%
    ABCD
    1 1 1 1 1 39.45±1.20
    2 1 2 2 2 56.27±0.09
    3 1 3 3 3 55.54±0.09
    4 2 1 2 3 47.25±0.77
    5 2 2 3 1 47.10±0.56
    6 2 3 1 2 57.18±0.69
    7 3 1 3 2 39.20±1.41
    8 3 2 1 3 55.35±0.77
    9 3 3 2 1 53.90±0.98
    K1 50.420 41.967 50.663 46.817
    K2 50.513 52.907 52.473 50.886
    K3 49.483 55.542 47.280 52.713
    R 1.030 13.575 5.193 5.896
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    表 5  方差分析结果

    Table 5.  Results of variance analysis

    因素
    Factor
    Ⅲ型平方和
    SS
    自由度
    df
    均方
    MS
    F显著性
    Significance
    A 3.577 2 1.945 2.715 *
    B 129.682 2 310.934 433.895 **
    C 25.342 2 41.698 58.188 **
    D 48.491 2 54.665 76.282 **
    误差 Error 6.45 9
    注:*. 显著性相关 (P<0.05);**. 极显著性相关 (P<0.01) Note: *. significant at 0.05 level (P<0.05); **. very significant at 0.01 level (P<0.01)
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    表 6  不同降解程度坛紫菜多糖的理化性质

    Table 6.  Physicochemical properties of polysaccharides in P. haitanensis at different degradation levels

    样品
    Sample
    蛋白质
    Protein/%
    硫酸基
    Sulfate-group/%
    3,6-内醚半乳糖
    3,6-anhydrogalactose/%
    相对黏度
    Relative viscosity
    分子量Mp
    Molecular mass/D
    降解前多糖 PP 6.96±0.36a 11.25±0.89c 12.41±0.59a 5.86±0.31a >670 000
    降解1.5 h多糖 LPP1 5.73±0.34b 12.24±1.11c 9.72±0.67b 4.82±0.15b 399 894
    降解2.0 h多糖 LPP2 4.03±0.24c 14.32±0.96b 8.78±0.59b 3.67±0.09c 237 113
    降解2.5 h多糖 LPP3 3.23±0.89c 17.51±0.28a 6.82±0.09c 3.56±0.13c 235 835
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    [19] 蔡苗苗陈胜军杨贤庆马海霞邓建朝李春生胡晓戚勃 . 舌状蜈蚣藻蛋白质的提取及其抗氧化活性研究. 南方水产科学, 2020, 16(2): 119-126. doi: 10.12131/20190232
    [20] 钱佳慧栗志民申玉春刘志刚张武财 . 温度和盐度对华贵栉孔扇贝抗氧化酶活性的联合效应研究. 南方水产科学, 2015, 11(6): 49-57. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.06.007
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-29
  • 录用日期:  2019-11-28
  • 网络出版日期:  2019-12-06
  • 刊出日期:  2020-02-01

超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖及其抗氧化活性的研究

    作者简介:黄海潮 (1995—),女,硕士研究生,从事海洋藻类功能因子生物活性研究。E-mail: 1798721042@qq.com
    通讯作者: 杨贤庆, yxqgd@163.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/国家水产品加工技术研发中心/农业农村部水产品加工重点实验室,广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学食品学院,上海 201306
  • 3. 韩山师范学院食品工程与生物科技学院,广东 潮州 521041

摘要: 该试验比较了超声波法、过氧化氢法、超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜 (Porphyra haitanensis) 多糖的效果,最后以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 自由基清除率为指标,通过单因素和正交试验优化了超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖的工艺。对比了降解前后多糖的抗氧化活性,并分析了其与分子量、结构特征及理化性质等的相关性。结果表明,在过氧化氢体积分数10%、温度65 ℃、超声波辅助2.5 h条件下,该多糖降解前后DPPH自由基清除率的半抑制浓度 (Half maximal inhibitory concentration, IC50) 由9.37 mg·mL−1降为1.71 mg·mL−1;凝胶渗透色谱结果显示分子量由大于670 kD降为235 835 D;傅里叶红外光谱表明多糖特征吸收峰依旧存在;高效液相色谱分析发现单糖组成大致相同,糖醛酸质量分数有所降低;理化性质显示硫酸基质量分数增高,3,6-内醚半乳糖质量分数明显降低。因而超声波辅助过氧化氢法可较好地降解坛紫菜多糖,并可改善理化性质及结构特征进而增强抗氧化活性,为低分子量多糖的制备及构效关系分析提供依据。

English Abstract

  • 坛紫菜 (Porphyra haitanensis) 是中国重要的经济红藻,主要分布于浙江、福建、广东沿岸[1],其营养价值丰富,多糖约占20%~40%,主要是由“β-(1→3)-D-半乳糖”与“α-(1→4)-3,6-内醚-L-半乳糖”连接的琼二糖重复单元组成的硫酸化多糖[2],具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等多种生理功能[3-5],在保健食品、海洋药物、化妆品等领域具有较大的发展空间和应用前景。然而,该多糖相对分子质量大、结构复杂,溶解性较差且黏度高,不利于穿越多重细胞膜进入体内发挥生物活性,相关研究也因此受到限制[6-8]。研究表明,通过适宜方法降解得到一定分子量的多糖片段,通常具有更卓越的生理功能,并可降低在应用中可能产生的抗原性和毒副作用,有利于提高生物利用率[6-10]。坛紫菜多糖具有较好的抗氧化活性[8-10],适度降解可有效改善其活性。Zhou等[8]实验表明超声波降解紫菜多糖可显著提高其超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率 (P<0.05),且降解产物纯化组分的超氧阴离子自由基清除能力、还原力与分子量大小负相关。Zhao等[9]采用自由基降解法制备低分子量坛紫菜多糖,其还原力和清除自由基能力随分子量降低而明显增强。Gong等[10]将坛紫菜多糖按不同程度降解,所得降解后多糖的分子量越低,抗氧化活性越强。因而,通过适当方法将坛紫菜多糖分子质量降低,是充分发挥其抗氧化活性的重要途径。

    目前低分子质量海藻多糖的制备主要有化学法、物理法、酶法和自由基降解法[6-11]。生物降解法条件温和且分子量较易控制,但酶制剂价格昂贵且专一性酶不易获得[6]。化学降解 (酸法、碱法) 效率高,但容易破坏硫酸基等活性结构且产物均一性差,并对环境污染大且较难脱除[11]。物理降解污染少、操作简便,但降解程度较低,且成本较高、处理量小,不利于工业生产[8]。因此,对降解方法的选择、影响降解效果的因素优化、降解过程伴随的变化进行系统研究以及实现多糖的定向和可控性降解具有重要意义。

    超声波辅助过氧化氢降解法属于自由基降解的一种[10-13],该方法在降解坛紫菜多糖以提高抗氧化活性的应用中尚未见报道。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 自由基清除率被广泛用于评价多糖等天然化合物的抗氧化能力[14-15],因而本试验以DPPH自由基清除率为指标进行工艺优化,并对降解前后多糖的DPPH自由基清除能力、分子量、红外表征和单糖组成进行比较[16-17]。同时对降解过程中多糖的糖基质量分数、相对黏度、溶解性等理化性质进行分析[12],初步探索超声波辅助过氧化氢降解产物的构效关系,以期为坛紫菜制备高功能活性的低分子量多糖及高值化利用提供理论参考依据。

    • 坛紫菜购于广东省饶平县。DPPH购自美国Sigma公司;木瓜蛋白酶 (6×103 U·mg−1) 购自广州市齐云生物技术有限公司;透析袋MWCO3000、MWCO7000购自广州华屿欣实验器材有限公司;无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、硫酸钠、氢氧化钠等其他试剂均为国产分析纯。

    • BS224S分析天平 (美国Sartorius公司);XT-500A型粉碎机 (金华永康红太阳机电有限公司);Milli-Q超纯水机 (美国Millipore公司);HWS24电热恒温水浴锅 (上海一恒科学仪器有限公司);Alpha1-4冷冻干燥机 (德国Christ有限公司);ISI26 pH计 (上海仪迈仪器科技有限公司);IRAffinity-1红外光谱仪 (岛津企业管理中国有限公司);Agilent 1100高效液相色谱仪 (安捷伦科技中国有限公司);检测仪器:Waters ACQUITYUPLCH-Class高效液相色谱仪 (沃特世科技上海有限公司);RE-5220A旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);G-100S (800 W、40 kHz) 超声波清洗机 (深圳市歌能清洗设备有限公司);AvantiJ26XP高速离心机 (德国Sigma公司);Synergy全功能酶标仪 (美国BioTek公司);A11超微粉碎机(德国IKA公司);乌氏黏度计 (0.5~0.6 mm,南京桑力电子设备厂)。

    • 取100 g干坛紫菜粉碎后过40目筛,加入1 000 mL 95%乙醇超声波辅助脱脂及小分子色素1 h,滤渣于50 ℃烘干得浅灰色干粉。将粉末按40∶1 (mL·g−1) 水料比沸水浴3 h,冷却后过滤得粗多糖溶液,浓缩至1/3体积,加入3 000 U·mL−1木瓜蛋白酶,55 ℃酶解3 h脱蛋白。多糖溶液经7 kD透析袋流水透析2 d,蒸馏水透析1 d。透析液适当浓缩后,4倍体积醇沉过夜,离心收集沉淀并冷冻干燥24 h。将提取物超微粉碎得灰白色坛紫菜多糖 (P. haitanensis polysaccharides,PP) 备用。

    • 参照马军等[15]的方法,并略作修改。取2 mL一定浓度坛紫菜多糖溶液加入2 mL 0.2 mmol·L−1 DPPH-甲醇溶液,混合均匀后于暗处反应30 min,测定517 nm处吸光值A1。空白组以甲醇代替多糖,测定吸光值A0,样品本底组以蒸馏水代替DPPH-甲醇溶液,测定吸光值A2。半抑制浓度 (Half maximal inhibitory concentration, IC50) 表示当DPPH清除率为50%时所对应的多糖浓度。IC50越小,表明多糖DPPH清除能力越强[16]

      ${\text{清除率}} = \frac{{{A_0} - ({A_1} - {A_2})}}{{{A_0}}} \times 100{ {\text{%}}} $

    • 精确称量PP溶于蒸馏水,加入一定体积30%过氧化氢,保证多糖质量浓度为5 mg·mL−1。降解一定时间后冷却至室温,用0.01 mol·L−1氢氧化钠 (NaOH) 调节溶液pH至中性,3 kD透析袋流水透析2 d,蒸馏水透析1 d。将透析液浓缩至1/4体积,5倍体积95%乙醇4 ℃静置沉淀12 h,离心 (14 000 r·min−1,30 min) 后冻干得降解后多糖 (Low molecular mass P. haitanensis polysaccharides,LPP,以水杨酸法[7]检测过氧化氢是否除净)。

      参照相关文献[8, 18-19]研究3种方法在相对较优条件下降解坛紫菜多糖,分别为:1) 超声波降解,超声波频率40 kHz,反应温度55 ℃,反应时间2.0 h;2) 过氧化氢降解,8% (体积分数,以下同) 过氧化氢,反应温度55 ℃,反应时间2.0 h;3) 超声波辅助过氧化氢降解,超声波频率40 kHz,8% 过氧化氢,反应温度55 ℃,反应时间2.0 h。将这3种方法降解后的多糖配置成5 mg·mL−1溶液,测定DPPH自由基清除率并计算得率,判断3种方法降解的能力和效率。

      ${\rm{LPP}}{\text{得率}} = \frac{{{w_2}}}{{{w_1}}} \times 100{ {\text{%}}} $

      其中w2为降解后多糖质量 (g),w1为降解前多糖质量 (g)。

    • 以DPPH自由基清除率为指标 (多糖质量浓度为5 mg·mL−1),结合文献[10, 12-13]初步确定适于超声波辅助过氧化氢法降解PP的各因素及水平 (表1),固定条件为多糖质量浓度5 mg·mL−1,超声波频率40 kHz,6%过氧化氢,温度55 ℃、时间2.0 h。根据单因素试验结果,设计正交试验L9(34) 因素水平表 (表2),确定最佳工艺参数并计算LPP得率。

      因素
      Factor
      水平
      Level
      多糖质量浓度
      Concentration of polysaccharide/(mg·mL−1)
      2.5、5.0、7.5、10.0、12.5
      过氧化氢体积比 Volume ratio/(mL·mL−1) 4%、6%、8%、10%、12%
      反应温度 Reaction temperature/℃ 35、45、55、65、75
      反应时间 Reaction time/h 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5

      表 1  单因素试验因素及水平表

      Table 1.  Single factor design for the experiment

      水平 Level123
      因素
      Factor
      (A) 多糖浓度
      Concentration of polysaccharide/(mg·mL−1)
      2.5 5.0 7.5
      (B) 反应温度
      Reaction temperature/℃
      55 65 75
      (C) 过氧化氢体积比
      Volume ratio/(mL·mL−1)
      6% 8% 10%
      (D) 反应时间
      Reaction time/h
      1.5 2.0 2.5

      表 2  正交试验因素及水平表

      Table 2.  Factors and levels used in orthogonal experiment

    • 分别配制质量浓度依次为2、4、6、8、10 mg·mL−1的PP和LPP溶液,按照1.3.2方法测定并以维生素C (Vc) 做阳性对照,比较降解前后多糖DPPH自由基的清除能力。

    • 采用凝胶渗透色谱 (Gel permeation chromatography,GPC) 法[9]测定分子量。将不同分子量的葡聚糖标准品和待测样品配成0.5 mg·mL−1流动相溶液,经0.22 µm滤膜后进样,根据保留时间由GPC软件计算分子量。色谱柱为Tosoh Biosep®G4000SWXL (7.8 mm×300 mm);检测器为示差折光检测器;流动相为0.2 mol·L−1 硫酸钠 (Na2SO4);流速0.7 mL·min−1;柱温40 ℃;进样量10 µL。

    • 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 (1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP) 柱前衍生法[20],将14种单糖标准品及样品经三氟乙酸 (TFA) 水解后进行PMP衍生。水相用0.45 μm滤膜过滤后供高效液相色谱 (High performance liquid chromatography,HPLC) 进样分析。色谱柱为GreatSmart RP18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为100 mmol·L−1磷酸钠缓冲液 (pH=6.7);流动相B为乙腈;检测波长250 nm;柱温30 ℃;流速1 mL·min−1;进样量5 μL,进行梯度洗脱。

    • 采用溴化钾 (KBr) 压片法[21],分别取5~10 mg 样品粉末,在波数4 000~400 cm−1进行傅里叶红外光谱扫描。

    • 测定所优化条件下降解1.5、2.0和2.5 h的多糖LPP1、LPP2和LPP3的化学组成及相对黏度、分子量等物理性质。蛋白质、硫酸基、3,6-内醚半乳糖质量分数测定分别采用考马斯亮蓝法[12]、氯化钡-明胶比浊法[9]、间苯二酚比色法[9];相对黏度测定采用乌氏黏度计法[12];分子量测定采用GPC法。

    • 试验数据采用Excel 2010进行整理,均以3次试验结果的“平均数±标准差 ($\overline X \pm {\rm{SD}} $)”表示,采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行方差和组间差异分析,以P<0.05作为显著性差异标准。

    • 超声波法和过氧化氢法所得降解后多糖DPPH清除率分别为28.21%和30.05%,超声波辅助过氧化氢法降解后多糖DPPH清除率为48.56% (表3)。两者单独降解所得产物的抗氧化活性相当 (P>0.05) 且均弱于联合降解产物,说明超声波辅助过氧化氢法降解可显著提高坛紫菜多糖的抗氧化活性 (P<0.05)。

      降解方法
      Degradation method
      对DPPH清除率
      DPPH scavenging rate/%
      得率
      Yield/%
      GPC保留时间
      Retention time/min
      分子量Mp
      Molecular mass/D
      超声波法 Ultrasonic method 28.21±0.63b 86.08±4.13a 14.93 >670 000
      过氧化氢法 Hydrogen peroxide method 30.05±0.36b 75.92±2.37b 14.97 602 661
      超声波辅助过氧化氢法
      Ultrasonic assisted hydrogen peroxide method
      48.56±1.51a 65.04±2.56c 15.20 402 065
      注:同列不同上标字母表示组间差异性显著 (P<0.05),表 6同此 Note: Different superscript letters in the same column indicated significant difference between groups (P<0.05); the same case in Tables 6

      表 3  3种降解方法的抗氧化作用和降解能力

      Table 3.  Antioxidant activity and degradation capacity of the three degradation methods

      有研究表明,降解程度增高会产生更多小分子片段,透析后有更大损失,超声波法降解产物得率 (86.08%) 高于过氧化氢法 (75.92%),联合降解最低 (65.04%,表3),因而超声波辅助过氧化氢法较两者单独降解程度更高[22]。GPC保留时间可反映分子量变化,保留时间越大,分子量越小[17]。超声波法和过氧化氢法降解后多糖分子量分别为大于670 kD (保留时间14.93 min) 和602 661 D (保留时间14.97 min),然而超声波辅助过氧化氢法降解后多糖分子量大大降低为402 065 D (保留时间15.20 min),直观地表明两者联合降解程度更高 (表3)。

      与抗氧化活性比较发现,坛紫菜多糖抗氧化活性和分子量大小密切相关,具体为分子量大小和抗氧化活性呈负相关,与Zhou等[8]、Zhao等[9]的试验结论一致。因而可以DPPH自由基清除率为指标,探究超声波辅助过氧化氢法降解制备低分子量坛紫菜多糖工艺,旨在获得更具生物活性的低分子量多糖,使得降解更具针对性。

    • 多糖浓度对其降解有一定影响 (图1-a)。当质量浓度为5 mg·mL−1时,清除率最高 (50.98%)。浓度过低时分子间距离大,根据“空穴效应”[23]不利于超声波对多糖的空化作用,未能保证与降解剂充分接触;多糖浓度过高时,多糖高分子间易形成胶团且分子排列紧密,分子链不易断裂,从而影响降解效果[8]。因此,此条件下多糖最适质量浓度为2.5~7.5 mg·mL−1

      图  1  多糖质量浓度、过氧化氢体积分数、温度、时间对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼清除率的影响

      Figure 1.  Effect of polysaccharide concentration, hydrogen peroxide volume fraction, temperature and time on DPPH scavenging rate

      过氧化氢用量对多糖降解影响较为显著 (图1-b)。随过氧化氢用量增加,清除率从49.35%升至66.54%,8%之后清除率开始下降,10%时的清除率 (56.23%) 和6%时 (55.96%) 差异不显著 (P>0.05)。DPPH自由基清除率增高与该过程分子量减小和活性多糖片段增多有关。然而,过氧化氢过多时清除率开始下降,可能由于过氧化氢会和自身反应,用于自身的清除及与·OH重结合[24],造成降解剂减少;另外可能会导致多糖羟基末端氧化,致使羟基及其他活性基团减少,影响活性发挥[25]。总之,过氧化氢添加量不易过高,以体积分数6%~10%为宜。

      当温度由35 ℃升至75 ℃时,清除率呈先升高后降低趋势 (图1-c),65 ℃时达到最大 (59.06%),因而适当提高反应温度有利于活性增强。但温度过高时过氧化氢开始分解,降解效率下降,且可能使活性片段数目减少[26],因此清除率下降。因此最适温度为55~75 ℃。

      随反应时间延长,降解程度不断加强,所得降解多糖清除率随之升高 (图1-d)。当反应2 h时清除率达最高值 (57.74%),2~3 h之间清除率趋于平缓 (P>0.05),可能和该降解方法存在一定降解限度有关[13, 27];在2.5 h时 (57.36%) 有轻微下降趋势,可能是降解程度高使得活性片段减少或活性聚合结构有所破坏导致。因此,确定该条件下反应1.5~2.5 h为宜。

    • 各因素对抗氧化活性的影响程度依次为B (过氧化氢体积分数) >D (反应时间) >C (温度) >A (多糖浓度) (表4表5)。最佳合成工艺为B3D3C2A2,即过氧化氢体积分数为10%、反应时间2.5 h、反应温度65 ℃、底物质量浓度5 mg·mL−1。方差分析可得4个试验因素对LPP的DPPH自由基清除率在统计学上均有显著影响 (表5)。为确保试验结果合理性,按最佳工艺条件对PP降解3次,所得LPP的DPPH自由基清除率为 (61.83±0.65)%,高于正交试验所得最高值,可实现坛紫菜多糖通过超声波辅助过氧化氢法降解达到提高其抗氧化活性的目的。另外,LPP得率较高 (67.20±1.20)%,该优化工艺条件稳定可靠。

      序号
      No.
      因素
      Factor
      DPPH清除率
      DPPH scavenging rate/%
      ABCD
      1 1 1 1 1 39.45±1.20
      2 1 2 2 2 56.27±0.09
      3 1 3 3 3 55.54±0.09
      4 2 1 2 3 47.25±0.77
      5 2 2 3 1 47.10±0.56
      6 2 3 1 2 57.18±0.69
      7 3 1 3 2 39.20±1.41
      8 3 2 1 3 55.35±0.77
      9 3 3 2 1 53.90±0.98
      K1 50.420 41.967 50.663 46.817
      K2 50.513 52.907 52.473 50.886
      K3 49.483 55.542 47.280 52.713
      R 1.030 13.575 5.193 5.896

      表 4  正交试验设计及结果

      Table 4.  Orthogonal array design and results

      因素
      Factor
      Ⅲ型平方和
      SS
      自由度
      df
      均方
      MS
      F显著性
      Significance
      A 3.577 2 1.945 2.715 *
      B 129.682 2 310.934 433.895 **
      C 25.342 2 41.698 58.188 **
      D 48.491 2 54.665 76.282 **
      误差 Error 6.45 9
      注:*. 显著性相关 (P<0.05);**. 极显著性相关 (P<0.01) Note: *. significant at 0.05 level (P<0.05); **. very significant at 0.01 level (P<0.01)

      表 5  方差分析结果

      Table 5.  Results of variance analysis

    • 在试验所取浓度范围内,PP和LPP对DPPH自由基均具有良好清除作用,呈剂量依赖性,随质量浓度升高,清除作用逐渐增强 (图2)。PP对DPPH的清除率为7.20%~37.86%,LPP表现出更强清除率38.78%~71.26%。经对数拟合得出PP和LPP的IC50分别为9.37和1.71 mg·mL−1,表明LPP对DPPH自由基的清除效果显著高于PP (P<0.05),活性更接近于强抗氧化剂Vc。本研究结论和支梓鉴[28]的结果相似,通过Fe2+和过氧化氢降解果胶多糖,所得降解产物UFP-1和UFP-2的DPPH清除能力较原料多糖RP明显增强,且分子量较低的UFP-2抗氧化能力更强。从而在一定程度上反映出通过降解提高生物活性具有可行性。然而,多糖的抗氧化活性提高不是单方面的影响,而是诸多因素的综合作用。本试验将从坛紫菜多糖的分子量、红外结构、单糖组成及理化性质等方面分析其与抗氧化活性增强的相关性。

      图  2  坛紫菜多糖和降解后多糖、维生素C对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除效果的影响

      Figure 2.  Effects of PP, LPP and Vc on DPPH scavenging rate

    • GPC检测图谱显示PP和LPP的信号峰呈正态分布 (图3)。PP的保留时间为14.74 min,对应分子量大于670 kD,LPP保留时间为15.52 min,GPC软件分析表明其平均分子量 (Mw) 为205 198 D,数均分子量 (Mn) 为117 088 D,峰位分子量 (Mp) 为235 835 D,黏均分子量 (Mz) 为306 754 D。LPP分散系数为1.75,较PP峰窄,表明PP和LPP均为相对均一的大分子多糖,且LPP较PP更均一,长短链分布更集中,纯度更高。因而,超声波辅助过氧化氢法可有效降解坛紫菜多糖,并可获得均一性更好的多糖,这与徐雅琴等[17]的研究结果类似。此外,研究表明若单一采用过氧化氢法降解,降解后多糖分子量则会分布较宽,可能与特殊降解机制有关[29],然而多糖纯度越高越利于生物活性的发挥[3],因此,该降解方法也是坛紫菜多糖抗氧化活性增强的重要保证。

      图  3  坛紫菜多糖和降解后多糖的凝胶渗透色谱图

      Figure 3.  GPC chromatography of PP and LPP

    • PP和LPP红外光谱基本相似 (图4),特征吸收峰和重要官能团种类未发生变化,说明该方法降解坛紫菜多糖可能只是糖苷键断裂及分子量降低的过程,基本结构和活性基团没有被破坏[7]。1 228 cm−1左右为硫酸基的S=O对称伸缩振动吸收峰;812 cm−1左右表示连接在伯羟基上的C-O-S伸缩振动,且表明硫酸根连接在C-6位置;1 155 cm−1附近为内醚环C-O-C中糖苷键C-O的非对称伸缩振动峰;1 074 cm−1是吡喃糖环O-H的变角振动吸收峰;933 cm−1左右弱吸收峰为3,6-内醚半乳糖;891 cm−1左右即β型糖苷键吸收峰;812 cm−1左右表明含有半乳吡喃糖。因此,该多糖主要由β-D-半乳糖和3,6-内醚半乳糖组成。

      图  4  坛紫菜多糖和降解后多糖的红外光谱图

      Figure 4.  FT-IR of PP and LPP

      然而,可发现LPP较原始多糖PP在1 730 cm−1处多出1个吸收峰 (图4),经归属该峰是醛基的伸缩振动峰,即降解后坛紫菜多糖分子结构中增加了醛基。何喜珍等[19]研究表明相对于-COOH中的H来说,醛基中的C-H变得非常活泼,供电子能力及还原能力强,因而抗氧化活性更高。Zhao等[9]利用fenton法降解坛紫菜多糖时同样发现多出1 780和1 735 cm−1 两个吸收峰,表明降解过程中出现羰基,相似结果也出现在Zhi等[30]的研究中。因此,该吸收峰在坛紫菜多糖构效关系变化中可能起重要作用。

    • 14种混合标准单糖的液相色谱峰均得到较好分离 (图5)。通过与标准单糖出峰时间比对,PP和LPP中甘露糖醛酸、甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、L-岩藻糖的摩尔比分别为0.02∶0.06∶0.13∶0.01∶0.03∶0.11∶0.75∶0.09∶11.17∶0.59和0.05∶0.04∶0.06∶0.03∶0.00∶0.10∶0.86∶0.26∶9.55∶0.53,单糖组成大致相同,均主要为半乳糖,占80%以上。但各单糖摩尔比不同,可能是单糖本身在支链和主链分布不均,降解又使各糖链降解程度不同导致[31]。值得关注的是降解后多糖糖醛酸摩尔数均有所降低,Gomez等[32]同样发现降解导致糖醛酸质量分数降低,并表明其可能变化成内酯,与抗氧化活性变化有一定相关性。然而,王凌等[33]表明绿色巴夫藻 (Pavlova viridis) 糖醛酸质量分数越高抗氧化活性越好,可能是不同多糖的化学组成及空间结构等不同导致对生物活性的影响不一致。

      图  5  标准单糖及坛紫菜多糖和降解后多糖的液相色谱图

      Figure 5.  HPLC of standard monosaccharides, PP and LPP

    • 坛紫菜多糖中蛋白质质量分数在降解过程中由6.96%降到3.23% (表6),多糖得到进一步纯化,多糖的纯度是影响生物活性的重要因素[3];硫酸基是发挥生物功能的重要基团,往往与抗氧化活性成正相关[5],该降解过程其质量分数由11.25%增加到17.51%,因此该降解使得活性基团暴露,且分子量越小硫酸基暴露越严重,可有效改善抗氧化活性[10];该降解过程对3,6-内醚半乳糖影响显著 (P<0.05),其质量分数由12.41%降至6.82%,说明该降解方法可能攻击到糖链上的内醚半乳糖环。马夏军等[12]的研究表明3,6-内醚半乳糖减少可降低多糖分子柔韧性而提高抗氧化活性。

      样品
      Sample
      蛋白质
      Protein/%
      硫酸基
      Sulfate-group/%
      3,6-内醚半乳糖
      3,6-anhydrogalactose/%
      相对黏度
      Relative viscosity
      分子量Mp
      Molecular mass/D
      降解前多糖 PP 6.96±0.36a 11.25±0.89c 12.41±0.59a 5.86±0.31a >670 000
      降解1.5 h多糖 LPP1 5.73±0.34b 12.24±1.11c 9.72±0.67b 4.82±0.15b 399 894
      降解2.0 h多糖 LPP2 4.03±0.24c 14.32±0.96b 8.78±0.59b 3.67±0.09c 237 113
      降解2.5 h多糖 LPP3 3.23±0.89c 17.51±0.28a 6.82±0.09c 3.56±0.13c 235 835

      表 6  不同降解程度坛紫菜多糖的理化性质

      Table 6.  Physicochemical properties of polysaccharides in P. haitanensis at different degradation levels

      降解2.0 h内分子量由大于670 kD (PP) 降至237 113 D (LPP2),而2.5 h后分子量为235 835 D (LPP3),相对黏度结果与分子量变化一致。表示该降解体系在初始阶段迅速进行,2.0 h后趋于平缓,主要因为多糖分子量相对较大时暴露的降解位点较多[23],同时分子量过低会导致弛豫时间缩短,反而不利于继续降解[27]。从而,超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖2.0 h已基本完成,也较好地解释了该试验时间单因素优化中,降解2.0~3.0 h后多糖DPPH自由基清除作用趋于平缓。

      除以上性质外,多糖颜色在降解过程中也发生了变化。PP为灰白色,降解后由于过氧化氢的漂白作用均呈纯白色,且具有更好水溶性,有助于增强抗氧化活性[18]。此外,糖液pH有所下降,和酸性基团的脱落或糖苷氧化成酸有关[34],这与单糖组成分析中糖醛酸含量降低相吻合,也在一定程度上影响抗氧化活性的发挥。

    • 本试验比较了3种方法降解坛紫菜多糖的效果,超声波辅助过氧化氢法表现出更好的生物活性和降解效率。超声波降解主要通过超声波产生的机械及热效应随机断裂糖苷键,降解程度低[8];过氧化氢降解则通过形成活性自由基夺取糖苷键上与C相连的H原子 (即氢抽提反应) 来实现降解,程度较高[24];而超声波辅助过氧化氢降解,超声波“空化”作用使多糖溶液高度均一化,增加糖苷键和氧化剂的接触机会[13];另外,降低反应活化能使反应体系能量增加,促使过氧化氢解离出大量高氧化性的·OH、·O2H、·H自由基,加速多糖分子链氧化断裂,降解程度更高、速度更快[30]。该法一般抽提多糖链中由1,4-糖苷键连接的C-1,C-4或C-5上的氢原子[9]。最终以DPPH自由基清除率为指标,优化了该法的降解工艺,在过氧化氢体积分数为10%、温度65 ℃、超声波2.5 h的条件下,IC50由9.37 mg·mL−1降至1.71 mg·mL−1,分子量由大于670 kD降至235 835 D。该法操作简单,可适性好,降解后坛紫菜多糖的抗氧化活性显著增强,分子量明显降低,并较好地保留了基本结构和活性基团,为制备低分子量活性多糖提供了可行方式。何喜珍等[19]同样比较了这3种方法对大豆多糖的降解效果,发现两者辅助降解速率更高,但不同的是多糖的抗氧化活性只在一定程度内和分子量呈负相关,分子量继续降低将不利于抗氧化活性的保持,这可能与空间结构或相关性质发生特殊改变有关,因而探究降解后坛紫菜多糖抗氧化活性增强的原因有重要意义。

      相关学者研究表明,通过降解使多糖具有更高抗氧化活性的影响因素可能有以下几点:1) 蛋白质等杂质含量降低,多糖得到纯化[3];2) 具有更好水溶性,活性部位与自由基接触面积变大[12];3) 硫酸基等活性基团充分暴露,易捕获自由基[9];4) 单糖组成、化学组成及含量有所变化[31];5) 醛基、羰基、硫酸酯等新基团生成[19];6) 分子柔韧性改变[12];7) 更多羟基与自由基直接反应增强[35];8) 供氢能力增强,通过提供氢与自由基形成稳定结构[9];9) 空间结构发生改变,分子间作用力及氢键作用力减弱[10];10) 高级立体结构、构象发生改变,包括侧链连接位置、支化结构以及糖苷键结合形式等[36]。本试验初步分析了坛紫菜多糖结构组成、理化性质等因素与降解产物抗氧化活性改善的相关性,其中GPC结果表示分子量明显降低;FT-IR表明多糖基本结构和活性基团保留;HPLC表示降解前后单糖组成类似;理化性质测定表示该法主要破坏不含硫酸基的内醚半乳糖,同时伴随糖醛酸脱落,均与降解产物抗氧化活性提高有很大相关性,但该法对多糖空间结构造成的改变及如何影响抗氧化活性还有待进一步研究。本研究为坛紫菜多糖的降解和构效关系分析提供了理论参考,为拓宽坛紫菜的应用范围提供了科学依据,有利于我国海藻资源的综合利用,对海洋药物及保健品开发具有重要意义。

参考文献 (36)

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