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斑鳢基因组中微卫星分布特征及野生种群遗传结构分析

上官清 陈昆慈 刘海洋 欧密 罗青 王亚坤 徐晟云 赵建

引用本文:
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斑鳢基因组中微卫星分布特征及野生种群遗传结构分析

    作者简介: 上官清 (1992—),女,硕士研究生,研究方向为水产养殖。E-mail: 664948706@qq.com;
    通讯作者: 赵建, zhaojian@prfri.ac.cn
  • 中图分类号: S 917.4

Characteristics of micorsatellites and genetic structure of wild Channa maculata

    Corresponding author: Jian ZHAO, zhaojian@prfri.ac.cn
  • CLC number: S 917.4

  • 摘要: 斑鳢 (Channa maculata) 是华南地区的本土经济鱼类,也是杂交鳢的亲本之一。养殖个体逃逸可能会对野生种群产生影响,存在种质混杂的风险,亟须开展野生资源的遗传背景分析。该研究分析了斑鳢基因组中微卫星标记的分布特征,筛选获得20个多态性位点构建多重PCR体系,对广州、化州、江华、南宁、阳江和邵武6个野生群体的遗传多样性和遗传结构进行了分析。结果显示,6个野生群体各位点的等位基因 (Na) 为3~28、有效等位基因 (Ne) 为1.28~14.88、观测杂合度 (Ho) 为0.10~1.00、期望杂合度 (He) 为0.14~0.95以及多态信息含量 (PIC) 为0.13~0.95。UPGAM系统进化树结果显示,化州和福建种群遗传关系最近,化州和江华种群遗传关系最远。该研究结果将为斑鳢的遗传监测和亲缘关系鉴定提供技术支持,为斑鳢种质资源养护及管理提供参考。
  • 图 1  斑鳢各群体采样地点

    Figure 1.  Sampling sites of six C. maculata populations

    图 2  基因组中微卫星数量随碱基重复次数变化趋势

    Figure 2.  Variation curve of number of SSRs in genome with repeat times

    图 3  6个斑鳢群体的UPGMA聚类树图

    Figure 3.  UPGMA dendrogram of six C. maculata populations

    表 1  斑鳢采集位置及数量

    Table 1.  Sampling sites and quantity of C. maculata in this study

    群体编号
    Population No.
    采样地点
    Sampling site
    经纬度
    Coordinate
    所属江段 (水系)
    Water system
    样本数量
    Quantity of samples
    样本采集部位
    Tissue of samples
    1 广州 GZ 112.25°E,23.06°N 河口 (珠江) 29 鳍条
    2 化州 HZ 110.65°E,21.92°N 鉴江 30 鳍条
    3 江华 JH 111.58°E,26.43°N 湘江 35 鳍条
    4 南宁 NN 108.22°E,22.79°N 邕江 (珠江) 33 鳍条
    5 阳江 YJ 111.78°E,22.26°N 漠阳江 41 鳍条
    6 邵武 SW 117.49°E,27.34°N 闽江 28 鳍条
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    表 2  斑鳢基因组序列中不同重复单元微卫星分布情况

    Table 2.  Distribution of different types of SSR in genomic sequence

    单元碱基数
    Number of base
    重复类型
    Type of repeat
    SSR数目
    Number of SSR
    出现频率
    Frequency/%
    平均分布频率
    Average distribution frequency/kb
    1 2 187 962 49.76 3.34
    2 4 139 672 26.30 4.49
    3 10 20 272 14.26 20.27
    4 31 6 059 7.29 103.46
    5 66 1 094 2.40 573.01
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    表 3  斑鳢基因组序列中不同重复单元微卫星的出现频率

    Table 3.  Frequency of classified repeat types of SSR in genomic sequence of C. maculata

    重复单元
    Repeat unit
    重复次数 Repeat times合计
    Total
    567891011121314151617181920≥21
    A/T 47 951 30 595 20 655 15 009 11 498 9 085 7 334 5 685 4 358 3 348 2 714 2 201 328 141
    C/G 4 830 3 552 2 415 1 320 737 462 365 288 214 183 154 97 167 999
    AC/GT 22 654 13 182 9 847 8 188 7 081 6 526 6 013 5 537 4 869 4 257 3 276 2 581 2 468 2 182 1 635 1 455 153 757
    AG/CT 7 028 3 756 2 298 1 487 1 043 838 637 583 524 424 351 280 293 265 211 183 52 034
    AT/AT 2 594 1 476 884 608 461 265 231 206 160 95 99 60 42 21 16 18 31 836
    CG/CG 171 83 20 11 3 24 620
    AAC/GTT 1 261 599 314 200 132 84 50 21 25 11 11 5 6 2 3 3 24 463
    AAG/CTT 816 303 181 105 68 54 33 30 24 14 9 9 12 6 9 3 2 21 742
    AAT/ATT 2 464 1 134 652 424 357 297 239 231 198 148 125 80 53 50 34 38 22 20 065
    ACC/GGT 478 203 106 66 33 20 8 2 13 711
    ACG/CGT 22 12 4 1 1 12 850
    ACT/AGT 484 194 132 102 66 52 41 27 21 26 16 17 8 7 6 2 5 13 683
    AGC/CTG 1 119 530 294 183 118 68 41 25 15 9 10 4 2 1 1 1 1 12 485
    AGG/CCT 1 198 525 321 220 121 86 45 35 17 14 5 3 1 10 071
    ATC/ATG 754 438 261 181 103 63 46 27 19 13 10 6 6 4 7 496
    CCG/CGG 59 14 3 1 1 5 611
    AAAC/GTTT 569 257 120 41 24 3 9 4 3 2 1 1 1 2 1 5 643
    AAAG/CTTT 138 72 38 34 25 16 9 7 6 2 3 2 1 4 975
    AAAT/ATTT 896 315 102 35 9 4 3 1 1 3 4 624
    AACC/GGTT 21 9 5 1 1 3 260
    AACG/CGTT 1 3 288
    AACT/AGTT 38 13 6 8 1 3 2 2 1 3 315
    AAGC/CTTG 4 1 1 3 286
    AAGG/CCTT 30 18 7 4 3 289
    AAGT/ACTT 32 9 5 2 2 2 1 1 3 242
    AATC/ATTG 88 40 30 17 13 11 3 3 2 1 1 1 3 192
    AATG/ATTC 96 51 26 14 7 11 4 3 1 1 3 000
    AATT/AATT 43 11 9 1 1 2 797
    ACAG/CTGT 160 63 36 11 5 5 4 1 2 2 1 1 2 738
    ACAT/ATGT 152 81 52 29 17 9 12 6 5 3 3 2 1 1 2 2 458
    ACCC/GGGT 24 4 2 101
    ACCG/CGGT 3 2 076
    ACCT/AGGT 13 5 1 1 2 090
    ACGC/CGTG 73 35 12 2 3 1 3 1 1 2 071
    ACGG/CCGT 5 1 1 941
    ACGT/ACGT 1 1 938
    ACTC/AGTG 80 42 12 23 12 5 3 4 1 2 3 3 2 1 938
    ACTG/AGTC 25 14 9 2 1 1 1 1 1 1 751
    AGAT/ATCT 230 159 122 69 70 51 40 32 17 25 11 16 6 11 4 7 3 1 710
    AGCC/CTGG 3 1 2 1 1 852
    AGCG/CGCT 7 1 845
    AGCT/AGCT 14 2 853
    AGGC/CCTG 22 9 7 5 1 1 1 838
    AGGG/CCCT 65 33 10 1 1 892
    ATCC/ATGG 186 78 54 22 14 7 4 1 1 2 1 787
    ATCG/ATCG 1 1 429
    ATGC/ATGC 2 1 2 442
    AAAAC/GTTTT 47 17 1 474
    AAAAG/CTTTT 15 3 4 2 1 1 1 1 410
    AAAAT/ATTTT 35 6 3 1 404
    AAACC/GGTTT 5 2 2 361
    AAACT/AGTTT 7 3 1 1 353
    AAAGC/CTTTG 2 1 1 345
    AAAGG/CCTTT 7 5 1 2 2 1 658
    AAAGT/ACTTT 4 2 1 1 1 1 1 644
    AAATC/ATTTG 2 3 1 634
    AAATT/AATTT 8 1 2 631
    AACAC/GTGTT 7 8 1 1 1 632
    AACAG/CTGTT 3 623
    AACAT/ATGTT 9 3 4 1 637
    AACCC/GGGTT 1 621
    AACCT/AGGTT 1 621
    AACTG/AGTTC 3 621
    AACTT/AAGTT 1 622
    AAGAC/CTTGT 1 1 1 2 627
    AAGAG/CTCTT 8 1 1 2 1 1 623
    AAGAT/ATCTT 7 2 4 1 1 611
    AAGCC/CTTGG 1 598
    AAGCT/AGCTT 13 2 1 598
    AAGGT/ACCTT 1 602
    AAGTC/ACTTG 74 11 10 4 1 602
    AAGTG/ACTTC 3 2 506
    AATAC/ATTGT 9 1 2 503
    AATAG/ATTCT 5 3 4 3 492
    AATAT/ATATT 19 10 2 1 2 1 2 493
    AATCC/ATTGG 1 581
    AATCT/AGATT 15 3 1 1 1 1 583
    AATGC/ATTGC 1 1 564
    AATGG/ATTCC 1 563
    AATGT/ACATT 4 564
    AATTC/AATTG 241 56 9 6 2 2 1 561
    ACACC/GGTGT 2 1 1 246
    ACACG/CGTGT 1 245
    ACACT/AGTGT 2 1 245
    ACAGC/CTGTG 8 3 1 259
    ACAGG/CCTGT 4 3 1 1 251
    ACAGT/ACTGT 12 3 1 1 242
    ACATC/ATGTG 1 225
    ACATG/ATGTC 1 224
    ACCAG/CTGGT 1 223
    ACCAT/ATGGT 2 2 222
    ACCCC/GGGGT 5 1 218
    ACCGG/CCGGT 1 212
    ACCTC/AGGTG 1 1 211
    ACGAG/CGTCT 1 1 209
    ACGAT/ATCGT 1 207
    ACTAT/AGTAT 7 5 1 3 3 1 206
    ACTCC/AGTGG 1 186
    ACTCT/AGAGT 1 1 1 1 185
    ACTGC/AGTGC 2 181
    ACTGG/AGTCC 1 179
    AGAGC/CTCTG 13 3 178
    AGAGG/CCTCT 42 29 7 5 8 12 3 12 4 2 1 162
    AGATC/ATCTG 3 37
    AGATG/ATCTC 1 1 1 34
    AGCAT/ATGCT 1 31
    AGCCC/CTGGG 2 30
    AGCGG/CCGCT 1 28
    AGCTC/AGCTG 2 27
    AGGCC/CCTGG 1 2 25
    AGGGC/CCCTG 1 22
    AGGGG/CCCCT 12 2 2 1 21
    ATATC/ATATG 3 1 4
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    表 4  斑鳢微卫星位点相关信息

    Table 4.  Information of 20 microsatellite loci from C. maculata

    多重PCR
    Multiplex PCR
    位点
    Locus
    引物序列 (5'−3')
    Primer sequence
    简单重复单元
    Repeat motif
    退火温度
    Annealing temperature/℃
    荧光标记
    Fluorescent label
    Multiplex set 1 BCM83 F: TGAGAGATTTCCTGGGAGAATTA (ATA)33 60 FAM
    R: AACAGAACAAACACAGAAAAGGC
    BCM9 F: AACTGAACCTCATTCAGAACCAA (AC)32 61 PET
    R: CTATCACCCAGTAAACTGCATCC
    BCM94 F: TAAATTTAAATGCCACATGGGAG (AAAC)32 61 VIC
    R: GCAACCAAAAATGTAGGAGTCTG
    Multiplex set 2 BL-12 F: ACACCATAACAGTGACAA (TCTA)24 59 FAM
    R: GAGCAGAGTCAGTGTAGGTT
    BL-18 F: CCATACCTACCCAACCTG (GATA)25 59 PET
    R: CATCCTCATCCAGACCAT
    BL-19 F: ATCCATACCTACCCAACC (AGAT)22 60 VIC
    R: CATCCTCATCCAGACCAT
    Multiplex set 3 BCM90 F: ATATATTCCCATGCTGTTGTTGC (AC)32 61 FAM
    R: TTGTATTGTCAAAATTGTGTGCG
    BCM11 F: TGCAAAGCACGATAAGAACTACA (TAA)33 58 PET
    R: TATCAAAACTTGCTGCCAATAGC
    BL-4 F: AAAGAGGAGATTTCTGGAT (AGA)42 59 VIC
    R: CTGCCTGTTTGTCTGTCA
    Multiplex set 4 BCM97 F: CCCTCACTCTCTATCCAGTCCTT (AC)32 60 FAM
    R: GAGGGGAAATAGCCAGTGTAATG
    BL-24 F: TTGCCTTGTACTGACATT (TCTA)29 61 VIC
    R: CTCCCATAGTGCTCCGTG
    BL-33 F: TGACACTCACAGCCTCAG (ATCT)24 58 PET
    R: CACAACGTGGGATACAAT
    Multiplex set 5 BCM87 F: GTTTTTACCACAGCCAAAAACTG (GT)32 60 FAM
    R: CTGGAATACATTCGCTGTCTAGC
    BCM10 F: TTTGTTCTGGCAAACACTTTAGA (ATA)33 62 PET
    R: CTTTGGCCCAAGTAGTCATATTT
    Multiplex set 6 BCM95 F: CACATGCTCCCTATAGACAGTCC (AC)32 59 FAM
    R: TATGTGAGCCGGATGATAGAGTT
    BL-3 F: GATTGAACCACTCACCCT (GTA)40 61 PET
    R: GTAAGAAGCAGCATTGCA
    BL-21 F: TGACACTCACAGCCTCAG (ATCT)24 58 FAM
    R: CACAACGTGGGATACAAT
    Multiplex set 7 BCM91 F: CAAGAAGAAGACTGATACTGGGG (GT)32 59 FAM
    R: GATACAGGCATCCAAATTCTGAG
    BCM12 F: TGTAAAAGCAGCTATTCTTTGTTTC (TTA)33 60 PET
    R: CAACACTACCACCACCACAACTA
    BL-34 F: GGAAGAAGCTGTAAGAGG (AAAC)22 58 VIC
    R: AGTTGGCAATGGTGGAGA
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    表 5  6个斑鳢群体的多样性指数

    Table 5.  Genetic diversity indices of six C. maculata populations

    位点
    Locus
    指数
    Index
    群体 Population平均
    Total
    广州 GZ化州 HZ江华 JH南宁 NN阳江 YJ邵武 SW
    BCM83 Na 11 8 4 8 10 8 8.166 7
    Ne 4.380 2 4.054 1 1.389 7 3.716 7 6.502 9 5.351 5 4.232 5
    Ho 0.793 1 0.500 0 0.028 6 0.697 0 0.829 3 0.392 9 0.540 2
    He 0.785 2 0.766 1 0.284 5 0.742 2 0.856 7 0.827 9 0.710 4
    PIC 0.741 0 0.719 0 0.267 0 0.692 0 0.828 0 0.789 0 0.672 7
    HWE 0.000 0 0.056 9 0.000 0 0.402 3 0.000 0 0.000 0
    BCM9 Na 5 13 8 15 9 8 9.666 7
    Ne 2.248 7 7.058 8 3.319 8 8.126 9 2.333 1 4.639 1 4.621 1
    Ho 0.551 7 0.633 3 0.057 1 0.666 7 0.487 8 0.250 0 0.441 1
    He 0.565 0 0.872 9 0.708 9 0.890 4 0.578 4 0.798 7 0.735 7
    PIC 0.524 0 0.844 0 0.655 0 0.866 0 0.550 0 0.751 0 0.698 3
    HWE 0.000 0 0.034 6 0.000 0 0.002 0 0.000 0 0.000 0
    BL-12 Na 8 17 8 9 21 11 12.333 3
    Ne 2.624 0 13.235 3 2.608 4 3.882 4 11.940 3 7.009 6 6.883 3
    Ho 0.413 8 0.633 3 0.484 8 0.818 2 0.850 0 0.555 6 0.626 0
    He 0.629 8 0.940 1 0.626 1 0.753 8 0.927 8 0.873 5 0.791 9
    PIC 0.580 0 0.919 0 0.552 0 0.715 0 0.911 0 0.843 0 0.753 3
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.231 8 0.000 0 0.000 0
    BL-18 Na 6 15 4 11 14 12 10.333 3
    Ne 4.805 7 9.556 8 2.688 9 3.067 6 7.837 3 8.615 4 6.095 3
    Ho 0.965 5 0.724 1 0.787 9 0.606 1 0.764 7 0.321 4 0.695 0
    He 0.805 8 0.911 1 0.637 8 0.684 4 0.885 4 0.900 0 0.804 1
    PIC 0.760 0 0.887 0 0.555 0 0.656 0 0.860 0 0.873 0 0.765 2
    HWE 0.005 8 0.000 0 0.000 0 0.000 1 0.000 0 0.000 0
    BL-19 Na 6 16 4 11 16 12 10.833 3
    Ne 4.805 7 9.523 8 2.688 9 3.071 9 7.305 9 8.209 4 5.934 3
    Ho 0.965 5 0.666 7 0.787 9 0.575 8 0.700 0 0.285 7 0.663 6
    He 0.805 8 0.910 2 0.637 8 0.684 8 0.874 1 0.894 2 0.801 2
    PIC 0.760 0 0.887 0 0.555 0 0.657 0 0.850 0 0.867 0 0.762 7
    HWE 0.005 8 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
    BCM90 Na 4 9 5 6 6 6 6.000 0
    Ne 2.345 9 5.056 2 2.411 4 1.716 7 2.614 3 3.359 4 2.917 3
    Ho 0.586 2 0.766 7 0.514 3 0.375 0 0.487 8 0.703 7 0.572 3
    He 0.583 8 0.815 8 0.593 8 0.424 1 0.625 1 0.715 6 0.626 4
    PIC 0.484 0 0.775 0 0.535 0 0.395 0 0.549 0 0.655 0 0.565 5
    HWE 0.364 7 0.245 4 0.000 0 0.001 7 0.506 0 0.616 0
    BCM11 Na 9 16 8 14 14 18 13.166 7
    Ne 7.218 9 11.612 9 1.354 3 7.920 0 6.146 3 9.467 5 7.286 7
    Ho 0.931 0 0.866 7 0.142 9 0.969 7 0.926 8 0.888 9 0.787 7
    He 0.876 6 0.929 4 0.265 4 0.887 2 0.847 6 0.911 3 0.786 3
    PIC 0.846 0 0.907 0 0.256 0 0.862 0 0.819 0 0.886 0 0.762 7
    HWE 0.002 5 0.296 9 0.000 0 0.931 0 0.000 0 0.478 9
    BL-4 Na 9 24 11 22 28 17 18.500 0
    Ne 3.706 9 15.929 2 7.538 5 13.212 9 9.261 7 12.255 3 10.317 4
    Ho 0.428 6 0.533 3 0.142 9 0.593 8 0.463 4 0.333 3 0.415 9
    He 0.743 5 0.953 1 0.899 5 0.939 0 0.903 0 0.937 9 0.896 0
    PIC 0.706 0 0.942 0 0.855 0 0.947 0 0.887 0 0.913 0 0.875 0
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
    BCM97 Na 6 9 5 7 11 9 7.833 3
    Ne 3.985 8 4.663 2 1.284 2 2.722 5 5.766 7 5.444 4 3.977 8
    Ho 1.000 0 0.633 3 0.151 5 0.575 8 0.829 3 0.857 1 0.674 5
    He 0.762 3 0.798 9 0.224 7 0.642 4 0.836 8 0.831 2 0.682 7
    PIC 0.714 0 0.762 0 0.211 0 0.573 0 0.809 0 0.792 0 0.643 5
    HWE 0.000 1 0.197 4 0.000 0 0.000 0 0.011 9 0.108 5
    BL-24 Na 10 16 5 12 14 8 10.833 3
    Ne 4.792 0 9.045 2 1.976 8 9.151 3 5.520 2 5.807 4 6.048 8
    Ho 0.724 1 0.500 0 0.000 0 0.848 5 0.702 7 0.321 4 0.516 1
    He 0.805 2 0.904 5 0.502 0 0.904 4 0.830 1 0.842 9 0.798 2
    PIC 0.763 0 0.880 0 0.462 0 0.881 0 0.804 0 0.805 0 0.765 8
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.215 7 0.000 0 0.000 0
    BL-33 Na 8 21 8 11 14 16 13.000 0
    Ne 4.847 3 14.754 1 2.927 1 2.773 4 3.705 2 8.166 7 6.195 6
    Ho 0.689 7 0.700 0 0.428 6 0.322 6 0.435 9 0.607 1 0.530 7
    He 0.807 6 0.948 0 0.667 9 0.649 9 0.739 6 0.893 5 0.784 4
    PIC 0.765 0 0.928 0 0.622 0 0.623 0 0.693 0 0.867 0 0.749 7
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.003 1
    BCM87 Na 8 9 5 9 10 9 8.333 3
    Ne 4.072 6 4.422 6 1.436 1 4.204 6 5.345 0 5.333 3 4.135 7
    Ho 0.724 1 0.466 7 0.000 0 0.606 1 0.829 3 0.535 7 0.527 0
    He 0.767 7 0.787 0 0.308 1 0.773 9 0.822 9 0.827 3 0.714 5
    PIC 0.725 0 0.750 0 0.290 0 0.732 0 0.791 0 0.788 0 0.679 3
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 1 0.000 0 0.000 0
    BCM10 Na 6 17 9 12 15 10 11.500 0
    Ne 3.689 4 10.526 3 4.702 5 5.613 4 9.391 1 6.400 0 6.720 5
    Ho 0.714 3 0.700 0 0.600 0 0.697 0 0.634 1 0.250 0 0.599 2
    He 0.742 2 0.920 3 0.798 8 0.834 5 0.904 5 0.859 1 0.843 2
    PIC 0.680 0 0.898 0 0.758 0 0.804 0 0.884 0 0.825 0 0.808 2
    HWE 0.000 0 0.000 1 0.000 0 0.015 6 0.000 0 0.000 0
    BCM95 Na 9 21 8 14 13 15 13.333 3
    Ne 5.339 7 13.235 3 2.110 2 11.000 0 6.331 5 7.466 7 7.580 6
    Ho 0.724 1 0.633 3 0.200 0 0.757 6 0.756 1 0.607 1 0.613 0
    He 0.827 0 0.940 1 0.533 7 0.923 1 0.852 5 0.881 8 0.826 4
    PIC 0.789 0 0.920 0 0.505 0 0.902 0 0.825 0 0.853 0 0.799 0
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.029 9 0.000 0 0.000 0
    BL-3 Na 9 14 10 19 18 14 14.000 0
    Ne 3.112 8 10.055 2 1.784 4 14.222 2 10.568 8 9.49 02 8.205 6
    Ho 0.150 0 0.333 3 0.171 4 0.458 3 0.208 3 0.409 1 0.288 4
    He 0.696 2 0.917 5 0.446 0 0.949 5 0.924 6 0.915 4 0.808 2
    PIC 0.653 0 0.892 0 0.430 0 0.925 0 0.898 0 0.886 0 0.780 7
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
    BL-21 Na 11 21 7 11 15 17 13.666 7
    Ne 5.360 3 14.876 0 2.822 6 2.998 2 4.224 1 9.286 6 6.594 6
    Ho 0.629 6 0.666 7 0.514 3 0.275 9 0.542 9 0.925 9 0.592 6
    He 0.828 8 0.948 6 0.655 1 0.678 2 0.774 3 0.909 2 0.799 0
    PIC 0.791 0 0.929 0 0.602 0 0.648 0 0.737 0 0.883 0 0.765 0
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.120 0
    BCM91 Na 8 6 3 8 8 7 6.666 7
    Ne 1.783 7 2.125 1 1.155 1 2.550 4 3.379 1 4.215 1 2.534 8
    Ho 0.103 4 0.333 3 0.028 6 0.363 6 0.450 0 0.107 1 0.231 0
    He 0.447 1 0.538 4 0.136 2 0.617 2 0.713 0 0.776 6 0.538 1
    PIC 0.427 0 0.506 0 0.128 0 0.567 0 0.654 0 0.733 0 0.502 5
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
    BCM12 Na 11 21 7 11 15 17 13.666 7
    Ne 5.360 3 14.876 0 2.822 6 2.998 2 4.224 1 9.286 6 6.594 6
    Ho 0.629 6 0.666 7 0.514 3 0.275 9 0.542 9 0.925 9 0.592 6
    He 0.828 8 0.948 6 0.655 1 0.678 2 0.774 3 0.909 2 0.799 0
    PIC 0.791 0 0.929 0 0.602 0 0.648 0 0.737 0 0.883 0 0.765 0
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.120 0
    BL-34 Na 6 11 5 8 11 8 8.166 7
    Ne 2.805 0 7.409 7 1.407 2 6.135 2 6.387 2 5.695 3 4.9733
    Ho 0.892 9 0.689 7 0.029 4 0.787 9 0.800 0 0.259 3 0.576 5
    He 0.655 2 0.880 2 0.293 7 0.849 9 0.854 1 0.840 0 0.728 9
    PIC 0.576 0 0.850 0 0.278 0 0.817 0 0.827 0 0.802 0 0.691 7
    HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.087 2 0.000 0 0.000 0
    BCM94 Na 3 12 4 5 7 3 5.666 7
    Ne 2.326 4 6.766 9 2.117 5 2.472 2 4.650 1 2.217 8 3.425 2
    Ho 0.620 7 0.633 3 0.171 4 0.333 3 0.634 1 0.107 1 0.416 7
    He 0.580 2 0.866 7 0.535 4 0.604 7 0.794 6 0.559 1 0.656 8
    PIC 0.507 0 0.837 0 0.492 0 0.545 0 0.754 0 0.475 0 0.601 7
    HWE 0.006 0 0.005 6 0.000 0 0.000 0 0.000 9 0.000 0
    注:Na. 等位基因;Ne. 有效等位基因;Ho. 观测杂合度;He. 期望杂合度;PIC. 多态信息含量;HWE. Hardy-Weinberg平衡偏离常数 Note: Na. Number of alleles; Ne. Effective number of alleles; Ho. Observed heterozygosity; He. Expected heterozygosity; PIC. Polymorphism Information Content; HWE. Hardy-Weinberg
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    表 6  6个斑鳢群体间的遗传距离

    Table 6.  Genetic distance among six C. maculata populations

    群体
    Population
    广州
    GZ
    化州
    HZ
    江华
    JH
    南宁
    NN
    阳江
    YJ
    邵武
    SW
    广州 GZ
    化州 HZ 0.117 69
    江华 JH 0.476 72 0.268 98
    南宁 NN 0.153 89 0.079 37 0.402 79
    阳江 YJ 0.120 51 0.067 34 0.361 52 0.106 18
    邵武 SW 0.154 59 0.065 88 0.399 60 0.114 65 0.066 38
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    表 7  6个斑鳢群体的遗传分化系数 (FST,对角线下) 和基因流 (Nm,对角线上)

    Table 7.  Gene differentiation (FST, above the diagonal) and gene flow indices (Nm, below the diagonal) among six C. maculata populations

    群体
    Population
    广州
    GZ
    化州
    HZ
    江华
    JH
    南宁
    NN
    阳江
    YJ
    邵武
    SW
    广州 GZ 2.124 4 0.524 4 1.624 5 2.074 5 1.617 2
    化州 HZ 0.105 3 0.929 4 3.150 0 3.712 6 3.794 7
    江华 JH 0.322 8 0.212 0 0.620 7 0.691 5 0.625 6
    南宁 NN 0.133 4 0.073 5 0.287 1 2.354 7 2.180 7
    阳江 YJ 0.107 6 0.063 1 0.265 5 0.096 0 3.766 1
    邵武 SW 0.133 9 0.061 8 0.285 5 0.102 9 0.062 3
    注:Nm=0.25 (1−FST)/FST,下表同此 Note: The same below
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    表 8  6个斑鳢群体的AMOVA分析

    Table 8.  Analysis on molecular variance (AMOVA) of six C. maculata populations

    变异来源
    Source of variation
    平方和
    Sum of squares
    变异组分
    Variance component
    变异百分比
    Variation percentage/
    %
    群体间 Among populations 460.645 1.347 32 15.18
    群体内 Within populations 2 796.240 7.529 68 84.82
    合计 Total 3 256.884 8.877 00
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-11
  • 录用日期:  2019-12-12
  • 刊出日期:  2020-06-01

斑鳢基因组中微卫星分布特征及野生种群遗传结构分析

    作者简介:上官清 (1992—),女,硕士研究生,研究方向为水产养殖。E-mail: 664948706@qq.com
    通讯作者: 赵建, zhaojian@prfri.ac.cn
  • 1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东 广州 510380
  • 2. 上海海洋大学,上海 201306

摘要: 斑鳢 (Channa maculata) 是华南地区的本土经济鱼类,也是杂交鳢的亲本之一。养殖个体逃逸可能会对野生种群产生影响,存在种质混杂的风险,亟须开展野生资源的遗传背景分析。该研究分析了斑鳢基因组中微卫星标记的分布特征,筛选获得20个多态性位点构建多重PCR体系,对广州、化州、江华、南宁、阳江和邵武6个野生群体的遗传多样性和遗传结构进行了分析。结果显示,6个野生群体各位点的等位基因 (Na) 为3~28、有效等位基因 (Ne) 为1.28~14.88、观测杂合度 (Ho) 为0.10~1.00、期望杂合度 (He) 为0.14~0.95以及多态信息含量 (PIC) 为0.13~0.95。UPGAM系统进化树结果显示,化州和福建种群遗传关系最近,化州和江华种群遗传关系最远。该研究结果将为斑鳢的遗传监测和亲缘关系鉴定提供技术支持,为斑鳢种质资源养护及管理提供参考。

English Abstract

  • 斑鳢 (Channa maculata) 隶属于硬骨鱼纲、鲈形目、攀鲈亚目、鳢科、鳢属[1],是我国重要的淡水经济鱼类[2]。其与乌鳢 (Channa argus) 杂交获得的杂交鳢具有明显的杂种优势[3],已成为主要养殖品种之一。随着鳢的养殖规模逐渐扩大,苗种和亲本需求量剧增,而斑鳢亲本源于早期饲料驯化群体,遗传多样性较低,近年来出现了近亲繁殖、种质退化,抗病能力下降等问题。同时由于杂交鳢可育,养殖群体逃逸到自然群体中会造成野生群体遗传混杂等问题,亟需开展野生资源的遗传背景分析。

    开展鱼类种群遗传背景研究有多种方法,包括形态学、同工酶及DNA水平。如陈薛伟杰等[4]利用形态学与框架分析法研究锦江和乌江大眼鳜 (Siniperca kneri) 群体与北盘江群体的形态差异;舒琥等[5]通过可量性状及框架结构发现华南及邻近地区的大刺鳅 (Mastacembelus armatus) 形态上存在明显分化;张龙岗等[6]发现苹果酸脱氢酶 (MDH) 和乙醇脱氢酶 (ADH) 可辨别乌鳢和杂交鳢。然而,以上均是对物种遗传变异的间接性反映,无法直接呈现出个体或群体间的遗传变异,而DNA序列的变异是遗传物质的改变,能够直接反映群体的遗传多样性和分化状况。

    随着分子生物学的发展,DNA水平上的变异检测先后发展出限制性内切酶片段长度多态性 (Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA标记 (Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性 (Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、微卫星 (Simple sequence repeats,SSR) 等多种方法。其中,微卫星作为一种共显性标记,具有分布广、数量多、多态性信息丰富以及易于检测等优点,已被广泛用于群体遗传、多样性监测、家系鉴定等工作[7-8]。目前已有利用微卫星标记对二长棘鲷 (Parargyrops edita)[9]、红螯螯虾 (Cherax quadricarinatus)[10]、鲍[11]、青蟹 (Scylla paramamosain)[12]等进行种群遗传多样性研究的报道。

    本研究利用高通量测序的方法对斑鳢进行微卫星标记开发,筛选多态性标记对我国自然分布区代表性野生群体进行种群遗传分析,为其种质的合理利用提供基础。

    • 2017年4月至2018年9月,分别从广东、广西、福建、湖南等斑鳢自然分布地采集到196尾活体样本,取其部分尾鳍置于含有无水乙醇的离心管中,后带回实验室−20 ℃保存备用。样本采集信息见表1,采样点分布见图1

      群体编号
      Population No.
      采样地点
      Sampling site
      经纬度
      Coordinate
      所属江段 (水系)
      Water system
      样本数量
      Quantity of samples
      样本采集部位
      Tissue of samples
      1 广州 GZ 112.25°E,23.06°N 河口 (珠江) 29 鳍条
      2 化州 HZ 110.65°E,21.92°N 鉴江 30 鳍条
      3 江华 JH 111.58°E,26.43°N 湘江 35 鳍条
      4 南宁 NN 108.22°E,22.79°N 邕江 (珠江) 33 鳍条
      5 阳江 YJ 111.78°E,22.26°N 漠阳江 41 鳍条
      6 邵武 SW 117.49°E,27.34°N 闽江 28 鳍条

      表 1  斑鳢采集位置及数量

      Table 1.  Sampling sites and quantity of C. maculata in this study

      图  1  斑鳢各群体采样地点

      Figure 1.  Sampling sites of six C. maculata populations

    • 参照试剂盒 (美国OMEGA Bio-Tek公司) NO. D3096-02说明书提取基因组DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行检测,−20 ℃保存备用。

    • 使用HiSeq2500高通量测序仪 (Illumina,USA) 对斑鳢基因组DNA进行“全基因组随机测序”,测序服务由深圳华大海洋科技有限公司提供。全基因组测序完成后进行拼接,过滤掉接头和低质量序列,使用软件MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html) 搜索微卫星位点。

    • 从获得的微卫星序列中,挑选在不同的Scaffold上,重复次数介于20~45的微卫星片段,若在相同Scaffold上,则选择在基因组中间距5 Mb以上的微卫星片段进行克隆,参考张新宇和高燕宇[13]引物设计原则,使用Primer 5.0软件设计引物。在正向引物5'端分别添加用蓝色 (FAM:AGCTCGACCAGTGAGTCAG)、红色 (PET:CACGACGTTGTAAAACGAC) 和绿色 (VIC:CAGGAACTCAGTGTGACACTC) 标记的不同接头序列,并交由广州天一辉远基因科技有限公司合成。

    • 引物筛选参考Wang等[14]的描述。

    • 采用Peak Scanner Software 1.0软件对荧光标记微卫星进行基因型判定,并记录在Excel表格中。利用Popgen 32来计算等位基因 (Na),有效等位基因 (Ne),观测杂合度 (Ho) 和期望杂合度 (He);使用Cervus软件统计多态信息含量 (PIC) 和哈迪-温伯格平衡 (HWE) 等种群遗传学参数;利用Arlequin 3.1软件计算种群间遗传距离、遗传分化系数 (FST) 和AMOVE方法分析6个群体的遗传差异;最后根据遗传距离在MEGA 5.1软件中构建UPMGA进化树。

    • 测序获得的数据量为318.4 Gb,经过处理组装得到基因组大小为627 Mb,共获得微卫星序列355 297条。检测出的SSR包含1、2、3、4和5个碱基重复单元的个数分别是187 962、139 672、20 272、6 059和1 094,5种重复微卫星出现频率分别是49.76%、26.30%、14.26%、7.29%和2.40% (表2)。随着碱基数的增加,不同重复单元出现的频率呈明显下降趋势。

      单元碱基数
      Number of base
      重复类型
      Type of repeat
      SSR数目
      Number of SSR
      出现频率
      Frequency/%
      平均分布频率
      Average distribution frequency/kb
      1 2 187 962 49.76 3.34
      2 4 139 672 26.30 4.49
      3 10 20 272 14.26 20.27
      4 31 6 059 7.29 103.46
      5 66 1 094 2.40 573.01

      表 2  斑鳢基因组序列中不同重复单元微卫星分布情况

      Table 2.  Distribution of different types of SSR in genomic sequence

      在单碱基重复中,A/T类型出现的频率最高(66.14%);2碱基重复中,AC/GT类型出现的频率最高 (58.63%);3碱基重复的SSR中AAC/GTT类型出现的频率最高 (17.21%);4碱基重复的SSR中AAAC/GTTT类型出现的频率最高 (7.77%);5碱基重复中,AAAGG/CCTTT类型出现的频率最高 (2.75%),不同重复单元SSR的出现频率见表3

      重复单元
      Repeat unit
      重复次数 Repeat times合计
      Total
      567891011121314151617181920≥21
      A/T 47 951 30 595 20 655 15 009 11 498 9 085 7 334 5 685 4 358 3 348 2 714 2 201 328 141
      C/G 4 830 3 552 2 415 1 320 737 462 365 288 214 183 154 97 167 999
      AC/GT 22 654 13 182 9 847 8 188 7 081 6 526 6 013 5 537 4 869 4 257 3 276 2 581 2 468 2 182 1 635 1 455 153 757
      AG/CT 7 028 3 756 2 298 1 487 1 043 838 637 583 524 424 351 280 293 265 211 183 52 034
      AT/AT 2 594 1 476 884 608 461 265 231 206 160 95 99 60 42 21 16 18 31 836
      CG/CG 171 83 20 11 3 24 620
      AAC/GTT 1 261 599 314 200 132 84 50 21 25 11 11 5 6 2 3 3 24 463
      AAG/CTT 816 303 181 105 68 54 33 30 24 14 9 9 12 6 9 3 2 21 742
      AAT/ATT 2 464 1 134 652 424 357 297 239 231 198 148 125 80 53 50 34 38 22 20 065
      ACC/GGT 478 203 106 66 33 20 8 2 13 711
      ACG/CGT 22 12 4 1 1 12 850
      ACT/AGT 484 194 132 102 66 52 41 27 21 26 16 17 8 7 6 2 5 13 683
      AGC/CTG 1 119 530 294 183 118 68 41 25 15 9 10 4 2 1 1 1 1 12 485
      AGG/CCT 1 198 525 321 220 121 86 45 35 17 14 5 3 1 10 071
      ATC/ATG 754 438 261 181 103 63 46 27 19 13 10 6 6 4 7 496
      CCG/CGG 59 14 3 1 1 5 611
      AAAC/GTTT 569 257 120 41 24 3 9 4 3 2 1 1 1 2 1 5 643
      AAAG/CTTT 138 72 38 34 25 16 9 7 6 2 3 2 1 4 975
      AAAT/ATTT 896 315 102 35 9 4 3 1 1 3 4 624
      AACC/GGTT 21 9 5 1 1 3 260
      AACG/CGTT 1 3 288
      AACT/AGTT 38 13 6 8 1 3 2 2 1 3 315
      AAGC/CTTG 4 1 1 3 286
      AAGG/CCTT 30 18 7 4 3 289
      AAGT/ACTT 32 9 5 2 2 2 1 1 3 242
      AATC/ATTG 88 40 30 17 13 11 3 3 2 1 1 1 3 192
      AATG/ATTC 96 51 26 14 7 11 4 3 1 1 3 000
      AATT/AATT 43 11 9 1 1 2 797
      ACAG/CTGT 160 63 36 11 5 5 4 1 2 2 1 1 2 738
      ACAT/ATGT 152 81 52 29 17 9 12 6 5 3 3 2 1 1 2 2 458
      ACCC/GGGT 24 4 2 101
      ACCG/CGGT 3 2 076
      ACCT/AGGT 13 5 1 1 2 090
      ACGC/CGTG 73 35 12 2 3 1 3 1 1 2 071
      ACGG/CCGT 5 1 1 941
      ACGT/ACGT 1 1 938
      ACTC/AGTG 80 42 12 23 12 5 3 4 1 2 3 3 2 1 938
      ACTG/AGTC 25 14 9 2 1 1 1 1 1 1 751
      AGAT/ATCT 230 159 122 69 70 51 40 32 17 25 11 16 6 11 4 7 3 1 710
      AGCC/CTGG 3 1 2 1 1 852
      AGCG/CGCT 7 1 845
      AGCT/AGCT 14 2 853
      AGGC/CCTG 22 9 7 5 1 1 1 838
      AGGG/CCCT 65 33 10 1 1 892
      ATCC/ATGG 186 78 54 22 14 7 4 1 1 2 1 787
      ATCG/ATCG 1 1 429
      ATGC/ATGC 2 1 2 442
      AAAAC/GTTTT 47 17 1 474
      AAAAG/CTTTT 15 3 4 2 1 1 1 1 410
      AAAAT/ATTTT 35 6 3 1 404
      AAACC/GGTTT 5 2 2 361
      AAACT/AGTTT 7 3 1 1 353
      AAAGC/CTTTG 2 1 1 345
      AAAGG/CCTTT 7 5 1 2 2 1 658
      AAAGT/ACTTT 4 2 1 1 1 1 1 644
      AAATC/ATTTG 2 3 1 634
      AAATT/AATTT 8 1 2 631
      AACAC/GTGTT 7 8 1 1 1 632
      AACAG/CTGTT 3 623
      AACAT/ATGTT 9 3 4 1 637
      AACCC/GGGTT 1 621
      AACCT/AGGTT 1 621
      AACTG/AGTTC 3 621
      AACTT/AAGTT 1 622
      AAGAC/CTTGT 1 1 1 2 627
      AAGAG/CTCTT 8 1 1 2 1 1 623
      AAGAT/ATCTT 7 2 4 1 1 611
      AAGCC/CTTGG 1 598
      AAGCT/AGCTT 13 2 1 598
      AAGGT/ACCTT 1 602
      AAGTC/ACTTG 74 11 10 4 1 602
      AAGTG/ACTTC 3 2 506
      AATAC/ATTGT 9 1 2 503
      AATAG/ATTCT 5 3 4 3 492
      AATAT/ATATT 19 10 2 1 2 1 2 493
      AATCC/ATTGG 1 581
      AATCT/AGATT 15 3 1 1 1 1 583
      AATGC/ATTGC 1 1 564
      AATGG/ATTCC 1 563
      AATGT/ACATT 4 564
      AATTC/AATTG 241 56 9 6 2 2 1 561
      ACACC/GGTGT 2 1 1 246
      ACACG/CGTGT 1 245
      ACACT/AGTGT 2 1 245
      ACAGC/CTGTG 8 3 1 259
      ACAGG/CCTGT 4 3 1 1 251
      ACAGT/ACTGT 12 3 1 1 242
      ACATC/ATGTG 1 225
      ACATG/ATGTC 1 224
      ACCAG/CTGGT 1 223
      ACCAT/ATGGT 2 2 222
      ACCCC/GGGGT 5 1 218
      ACCGG/CCGGT 1 212
      ACCTC/AGGTG 1 1 211
      ACGAG/CGTCT 1 1 209
      ACGAT/ATCGT 1 207
      ACTAT/AGTAT 7 5 1 3 3 1 206
      ACTCC/AGTGG 1 186
      ACTCT/AGAGT 1 1 1 1 185
      ACTGC/AGTGC 2 181
      ACTGG/AGTCC 1 179
      AGAGC/CTCTG 13 3 178
      AGAGG/CCTCT 42 29 7 5 8 12 3 12 4 2 1 162
      AGATC/ATCTG 3 37
      AGATG/ATCTC 1 1 1 34
      AGCAT/ATGCT 1 31
      AGCCC/CTGGG 2 30
      AGCGG/CCGCT 1 28
      AGCTC/AGCTG 2 27
      AGGCC/CCTGG 1 2 25
      AGGGC/CCCTG 1 22
      AGGGG/CCCCT 12 2 2 1 21
      ATATC/ATATG 3 1 4

      表 3  斑鳢基因组序列中不同重复单元微卫星的出现频率

      Table 3.  Frequency of classified repeat types of SSR in genomic sequence of C. maculata

      以碱基重复数为横坐标,SSR数量为纵坐标,结果见图2,SSR数量随着碱基重复次数的增加明显减少。

      图  2  基因组中微卫星数量随碱基重复次数变化趋势

      Figure 2.  Variation curve of number of SSRs in genome with repeat times

    • 使用Primer 5.0软件设计引物30对,根据Wang等[14]描述最终筛选出20个具有多态性且能稳定扩增的位点,构建7个多重PCR体系,用于6个斑鳢野生群体的扩增,结果见表4

      多重PCR
      Multiplex PCR
      位点
      Locus
      引物序列 (5'−3')
      Primer sequence
      简单重复单元
      Repeat motif
      退火温度
      Annealing temperature/℃
      荧光标记
      Fluorescent label
      Multiplex set 1 BCM83 F: TGAGAGATTTCCTGGGAGAATTA (ATA)33 60 FAM
      R: AACAGAACAAACACAGAAAAGGC
      BCM9 F: AACTGAACCTCATTCAGAACCAA (AC)32 61 PET
      R: CTATCACCCAGTAAACTGCATCC
      BCM94 F: TAAATTTAAATGCCACATGGGAG (AAAC)32 61 VIC
      R: GCAACCAAAAATGTAGGAGTCTG
      Multiplex set 2 BL-12 F: ACACCATAACAGTGACAA (TCTA)24 59 FAM
      R: GAGCAGAGTCAGTGTAGGTT
      BL-18 F: CCATACCTACCCAACCTG (GATA)25 59 PET
      R: CATCCTCATCCAGACCAT
      BL-19 F: ATCCATACCTACCCAACC (AGAT)22 60 VIC
      R: CATCCTCATCCAGACCAT
      Multiplex set 3 BCM90 F: ATATATTCCCATGCTGTTGTTGC (AC)32 61 FAM
      R: TTGTATTGTCAAAATTGTGTGCG
      BCM11 F: TGCAAAGCACGATAAGAACTACA (TAA)33 58 PET
      R: TATCAAAACTTGCTGCCAATAGC
      BL-4 F: AAAGAGGAGATTTCTGGAT (AGA)42 59 VIC
      R: CTGCCTGTTTGTCTGTCA
      Multiplex set 4 BCM97 F: CCCTCACTCTCTATCCAGTCCTT (AC)32 60 FAM
      R: GAGGGGAAATAGCCAGTGTAATG
      BL-24 F: TTGCCTTGTACTGACATT (TCTA)29 61 VIC
      R: CTCCCATAGTGCTCCGTG
      BL-33 F: TGACACTCACAGCCTCAG (ATCT)24 58 PET
      R: CACAACGTGGGATACAAT
      Multiplex set 5 BCM87 F: GTTTTTACCACAGCCAAAAACTG (GT)32 60 FAM
      R: CTGGAATACATTCGCTGTCTAGC
      BCM10 F: TTTGTTCTGGCAAACACTTTAGA (ATA)33 62 PET
      R: CTTTGGCCCAAGTAGTCATATTT
      Multiplex set 6 BCM95 F: CACATGCTCCCTATAGACAGTCC (AC)32 59 FAM
      R: TATGTGAGCCGGATGATAGAGTT
      BL-3 F: GATTGAACCACTCACCCT (GTA)40 61 PET
      R: GTAAGAAGCAGCATTGCA
      BL-21 F: TGACACTCACAGCCTCAG (ATCT)24 58 FAM
      R: CACAACGTGGGATACAAT
      Multiplex set 7 BCM91 F: CAAGAAGAAGACTGATACTGGGG (GT)32 59 FAM
      R: GATACAGGCATCCAAATTCTGAG
      BCM12 F: TGTAAAAGCAGCTATTCTTTGTTTC (TTA)33 60 PET
      R: CAACACTACCACCACCACAACTA
      BL-34 F: GGAAGAAGCTGTAAGAGG (AAAC)22 58 VIC
      R: AGTTGGCAATGGTGGAGA

      表 4  斑鳢微卫星位点相关信息

      Table 4.  Information of 20 microsatellite loci from C. maculata

    • 本研究中斑鳢的6个群体各位点的NaNeHoHe和PIC分别介于3~28、1.28~14.88、0.10~1.00、0.14~0.95、0.13~0.95;各群体的NaNeHoHe和PIC分布介于6.4~13.45、2.53~9.44、0.287 8~0.661 9、0.520 5~0.874 5、0.480 5~0.848 1,6个群体中,群体JH遗传多样性相对较低 (0.480 5),其余群体均呈现较高的多态性 (PIC>0.5),结果见表5。另外结果显示6个斑鳢群体的Hardy-Weinberg平衡偏离常数均小于0.05,说明6个斑鳢群体具有极显著的遗传不平衡。单群体单基因座检测结果显示,79.17%表现为极显著的遗传不平衡 (P<0.01);7.5%表现为显著的遗传不平衡 (0.01<P<0.05);13.33%表现为遗传平衡状态 (P>0.05)。

      位点
      Locus
      指数
      Index
      群体 Population平均
      Total
      广州 GZ化州 HZ江华 JH南宁 NN阳江 YJ邵武 SW
      BCM83 Na 11 8 4 8 10 8 8.166 7
      Ne 4.380 2 4.054 1 1.389 7 3.716 7 6.502 9 5.351 5 4.232 5
      Ho 0.793 1 0.500 0 0.028 6 0.697 0 0.829 3 0.392 9 0.540 2
      He 0.785 2 0.766 1 0.284 5 0.742 2 0.856 7 0.827 9 0.710 4
      PIC 0.741 0 0.719 0 0.267 0 0.692 0 0.828 0 0.789 0 0.672 7
      HWE 0.000 0 0.056 9 0.000 0 0.402 3 0.000 0 0.000 0
      BCM9 Na 5 13 8 15 9 8 9.666 7
      Ne 2.248 7 7.058 8 3.319 8 8.126 9 2.333 1 4.639 1 4.621 1
      Ho 0.551 7 0.633 3 0.057 1 0.666 7 0.487 8 0.250 0 0.441 1
      He 0.565 0 0.872 9 0.708 9 0.890 4 0.578 4 0.798 7 0.735 7
      PIC 0.524 0 0.844 0 0.655 0 0.866 0 0.550 0 0.751 0 0.698 3
      HWE 0.000 0 0.034 6 0.000 0 0.002 0 0.000 0 0.000 0
      BL-12 Na 8 17 8 9 21 11 12.333 3
      Ne 2.624 0 13.235 3 2.608 4 3.882 4 11.940 3 7.009 6 6.883 3
      Ho 0.413 8 0.633 3 0.484 8 0.818 2 0.850 0 0.555 6 0.626 0
      He 0.629 8 0.940 1 0.626 1 0.753 8 0.927 8 0.873 5 0.791 9
      PIC 0.580 0 0.919 0 0.552 0 0.715 0 0.911 0 0.843 0 0.753 3
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.231 8 0.000 0 0.000 0
      BL-18 Na 6 15 4 11 14 12 10.333 3
      Ne 4.805 7 9.556 8 2.688 9 3.067 6 7.837 3 8.615 4 6.095 3
      Ho 0.965 5 0.724 1 0.787 9 0.606 1 0.764 7 0.321 4 0.695 0
      He 0.805 8 0.911 1 0.637 8 0.684 4 0.885 4 0.900 0 0.804 1
      PIC 0.760 0 0.887 0 0.555 0 0.656 0 0.860 0 0.873 0 0.765 2
      HWE 0.005 8 0.000 0 0.000 0 0.000 1 0.000 0 0.000 0
      BL-19 Na 6 16 4 11 16 12 10.833 3
      Ne 4.805 7 9.523 8 2.688 9 3.071 9 7.305 9 8.209 4 5.934 3
      Ho 0.965 5 0.666 7 0.787 9 0.575 8 0.700 0 0.285 7 0.663 6
      He 0.805 8 0.910 2 0.637 8 0.684 8 0.874 1 0.894 2 0.801 2
      PIC 0.760 0 0.887 0 0.555 0 0.657 0 0.850 0 0.867 0 0.762 7
      HWE 0.005 8 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
      BCM90 Na 4 9 5 6 6 6 6.000 0
      Ne 2.345 9 5.056 2 2.411 4 1.716 7 2.614 3 3.359 4 2.917 3
      Ho 0.586 2 0.766 7 0.514 3 0.375 0 0.487 8 0.703 7 0.572 3
      He 0.583 8 0.815 8 0.593 8 0.424 1 0.625 1 0.715 6 0.626 4
      PIC 0.484 0 0.775 0 0.535 0 0.395 0 0.549 0 0.655 0 0.565 5
      HWE 0.364 7 0.245 4 0.000 0 0.001 7 0.506 0 0.616 0
      BCM11 Na 9 16 8 14 14 18 13.166 7
      Ne 7.218 9 11.612 9 1.354 3 7.920 0 6.146 3 9.467 5 7.286 7
      Ho 0.931 0 0.866 7 0.142 9 0.969 7 0.926 8 0.888 9 0.787 7
      He 0.876 6 0.929 4 0.265 4 0.887 2 0.847 6 0.911 3 0.786 3
      PIC 0.846 0 0.907 0 0.256 0 0.862 0 0.819 0 0.886 0 0.762 7
      HWE 0.002 5 0.296 9 0.000 0 0.931 0 0.000 0 0.478 9
      BL-4 Na 9 24 11 22 28 17 18.500 0
      Ne 3.706 9 15.929 2 7.538 5 13.212 9 9.261 7 12.255 3 10.317 4
      Ho 0.428 6 0.533 3 0.142 9 0.593 8 0.463 4 0.333 3 0.415 9
      He 0.743 5 0.953 1 0.899 5 0.939 0 0.903 0 0.937 9 0.896 0
      PIC 0.706 0 0.942 0 0.855 0 0.947 0 0.887 0 0.913 0 0.875 0
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
      BCM97 Na 6 9 5 7 11 9 7.833 3
      Ne 3.985 8 4.663 2 1.284 2 2.722 5 5.766 7 5.444 4 3.977 8
      Ho 1.000 0 0.633 3 0.151 5 0.575 8 0.829 3 0.857 1 0.674 5
      He 0.762 3 0.798 9 0.224 7 0.642 4 0.836 8 0.831 2 0.682 7
      PIC 0.714 0 0.762 0 0.211 0 0.573 0 0.809 0 0.792 0 0.643 5
      HWE 0.000 1 0.197 4 0.000 0 0.000 0 0.011 9 0.108 5
      BL-24 Na 10 16 5 12 14 8 10.833 3
      Ne 4.792 0 9.045 2 1.976 8 9.151 3 5.520 2 5.807 4 6.048 8
      Ho 0.724 1 0.500 0 0.000 0 0.848 5 0.702 7 0.321 4 0.516 1
      He 0.805 2 0.904 5 0.502 0 0.904 4 0.830 1 0.842 9 0.798 2
      PIC 0.763 0 0.880 0 0.462 0 0.881 0 0.804 0 0.805 0 0.765 8
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.215 7 0.000 0 0.000 0
      BL-33 Na 8 21 8 11 14 16 13.000 0
      Ne 4.847 3 14.754 1 2.927 1 2.773 4 3.705 2 8.166 7 6.195 6
      Ho 0.689 7 0.700 0 0.428 6 0.322 6 0.435 9 0.607 1 0.530 7
      He 0.807 6 0.948 0 0.667 9 0.649 9 0.739 6 0.893 5 0.784 4
      PIC 0.765 0 0.928 0 0.622 0 0.623 0 0.693 0 0.867 0 0.749 7
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.003 1
      BCM87 Na 8 9 5 9 10 9 8.333 3
      Ne 4.072 6 4.422 6 1.436 1 4.204 6 5.345 0 5.333 3 4.135 7
      Ho 0.724 1 0.466 7 0.000 0 0.606 1 0.829 3 0.535 7 0.527 0
      He 0.767 7 0.787 0 0.308 1 0.773 9 0.822 9 0.827 3 0.714 5
      PIC 0.725 0 0.750 0 0.290 0 0.732 0 0.791 0 0.788 0 0.679 3
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 1 0.000 0 0.000 0
      BCM10 Na 6 17 9 12 15 10 11.500 0
      Ne 3.689 4 10.526 3 4.702 5 5.613 4 9.391 1 6.400 0 6.720 5
      Ho 0.714 3 0.700 0 0.600 0 0.697 0 0.634 1 0.250 0 0.599 2
      He 0.742 2 0.920 3 0.798 8 0.834 5 0.904 5 0.859 1 0.843 2
      PIC 0.680 0 0.898 0 0.758 0 0.804 0 0.884 0 0.825 0 0.808 2
      HWE 0.000 0 0.000 1 0.000 0 0.015 6 0.000 0 0.000 0
      BCM95 Na 9 21 8 14 13 15 13.333 3
      Ne 5.339 7 13.235 3 2.110 2 11.000 0 6.331 5 7.466 7 7.580 6
      Ho 0.724 1 0.633 3 0.200 0 0.757 6 0.756 1 0.607 1 0.613 0
      He 0.827 0 0.940 1 0.533 7 0.923 1 0.852 5 0.881 8 0.826 4
      PIC 0.789 0 0.920 0 0.505 0 0.902 0 0.825 0 0.853 0 0.799 0
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.029 9 0.000 0 0.000 0
      BL-3 Na 9 14 10 19 18 14 14.000 0
      Ne 3.112 8 10.055 2 1.784 4 14.222 2 10.568 8 9.49 02 8.205 6
      Ho 0.150 0 0.333 3 0.171 4 0.458 3 0.208 3 0.409 1 0.288 4
      He 0.696 2 0.917 5 0.446 0 0.949 5 0.924 6 0.915 4 0.808 2
      PIC 0.653 0 0.892 0 0.430 0 0.925 0 0.898 0 0.886 0 0.780 7
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
      BL-21 Na 11 21 7 11 15 17 13.666 7
      Ne 5.360 3 14.876 0 2.822 6 2.998 2 4.224 1 9.286 6 6.594 6
      Ho 0.629 6 0.666 7 0.514 3 0.275 9 0.542 9 0.925 9 0.592 6
      He 0.828 8 0.948 6 0.655 1 0.678 2 0.774 3 0.909 2 0.799 0
      PIC 0.791 0 0.929 0 0.602 0 0.648 0 0.737 0 0.883 0 0.765 0
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.120 0
      BCM91 Na 8 6 3 8 8 7 6.666 7
      Ne 1.783 7 2.125 1 1.155 1 2.550 4 3.379 1 4.215 1 2.534 8
      Ho 0.103 4 0.333 3 0.028 6 0.363 6 0.450 0 0.107 1 0.231 0
      He 0.447 1 0.538 4 0.136 2 0.617 2 0.713 0 0.776 6 0.538 1
      PIC 0.427 0 0.506 0 0.128 0 0.567 0 0.654 0 0.733 0 0.502 5
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
      BCM12 Na 11 21 7 11 15 17 13.666 7
      Ne 5.360 3 14.876 0 2.822 6 2.998 2 4.224 1 9.286 6 6.594 6
      Ho 0.629 6 0.666 7 0.514 3 0.275 9 0.542 9 0.925 9 0.592 6
      He 0.828 8 0.948 6 0.655 1 0.678 2 0.774 3 0.909 2 0.799 0
      PIC 0.791 0 0.929 0 0.602 0 0.648 0 0.737 0 0.883 0 0.765 0
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.120 0
      BL-34 Na 6 11 5 8 11 8 8.166 7
      Ne 2.805 0 7.409 7 1.407 2 6.135 2 6.387 2 5.695 3 4.9733
      Ho 0.892 9 0.689 7 0.029 4 0.787 9 0.800 0 0.259 3 0.576 5
      He 0.655 2 0.880 2 0.293 7 0.849 9 0.854 1 0.840 0 0.728 9
      PIC 0.576 0 0.850 0 0.278 0 0.817 0 0.827 0 0.802 0 0.691 7
      HWE 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.087 2 0.000 0 0.000 0
      BCM94 Na 3 12 4 5 7 3 5.666 7
      Ne 2.326 4 6.766 9 2.117 5 2.472 2 4.650 1 2.217 8 3.425 2
      Ho 0.620 7 0.633 3 0.171 4 0.333 3 0.634 1 0.107 1 0.416 7
      He 0.580 2 0.866 7 0.535 4 0.604 7 0.794 6 0.559 1 0.656 8
      PIC 0.507 0 0.837 0 0.492 0 0.545 0 0.754 0 0.475 0 0.601 7
      HWE 0.006 0 0.005 6 0.000 0 0.000 0 0.000 9 0.000 0
      注:Na. 等位基因;Ne. 有效等位基因;Ho. 观测杂合度;He. 期望杂合度;PIC. 多态信息含量;HWE. Hardy-Weinberg平衡偏离常数 Note: Na. Number of alleles; Ne. Effective number of alleles; Ho. Observed heterozygosity; He. Expected heterozygosity; PIC. Polymorphism Information Content; HWE. Hardy-Weinberg

      表 5  6个斑鳢群体的多样性指数

      Table 5.  Genetic diversity indices of six C. maculata populations

    • 利用Arlequin 3.1软件得到6个斑鳢群体间的遗传距离 (表6),GZ和JH群体间遗传距离最大 (0.476 072),NN和JH群体间次之(0.402 79),HZ和SW群体间最小 (0.065 88)。基于UPMGA法利用MEGA 5.1软件对6个斑鳢群体进行聚类分析,结果显示,HZ和SW群体遗传距离最小,首先聚为一支,紧接着与YJ群体聚为一支,之后与NN和GZ群体聚为一支,最后与JH群体聚为一支 (图3)。

      图  3  6个斑鳢群体的UPGMA聚类树图

      Figure 3.  UPGMA dendrogram of six C. maculata populations

      群体
      Population
      广州
      GZ
      化州
      HZ
      江华
      JH
      南宁
      NN
      阳江
      YJ
      邵武
      SW
      广州 GZ
      化州 HZ 0.117 69
      江华 JH 0.476 72 0.268 98
      南宁 NN 0.153 89 0.079 37 0.402 79
      阳江 YJ 0.120 51 0.067 34 0.361 52 0.106 18
      邵武 SW 0.154 59 0.065 88 0.399 60 0.114 65 0.066 38

      表 6  6个斑鳢群体间的遗传距离

      Table 6.  Genetic distance among six C. maculata populations

      AMOVA分析结果表明6个斑鳢群体间的两两遗传分化系数FST介于0.061 8~0.322 8 (表7),群体间的遗传分化达到了极显著性水平 (P<0.01)。其中GZ和JH群体间的FST值最大 (0.322 8),NN和JH群体次之 (0.287 1),HZ和SW群体间最小 (0.061 8)。群体内和群体间的遗传变异分析结果显示,在总的遗传变异中,群体间的遗传变异占15.18%,而群体内的遗传变异占84.82% (表8)。

      群体
      Population
      广州
      GZ
      化州
      HZ
      江华
      JH
      南宁
      NN
      阳江
      YJ
      邵武
      SW
      广州 GZ 2.124 4 0.524 4 1.624 5 2.074 5 1.617 2
      化州 HZ 0.105 3 0.929 4 3.150 0 3.712 6 3.794 7
      江华 JH 0.322 8 0.212 0 0.620 7 0.691 5 0.625 6
      南宁 NN 0.133 4 0.073 5 0.287 1 2.354 7 2.180 7
      阳江 YJ 0.107 6 0.063 1 0.265 5 0.096 0 3.766 1
      邵武 SW 0.133 9 0.061 8 0.285 5 0.102 9 0.062 3
      注:Nm=0.25 (1−FST)/FST,下表同此 Note: The same below

      表 7  6个斑鳢群体的遗传分化系数 (FST,对角线下) 和基因流 (Nm,对角线上)

      Table 7.  Gene differentiation (FST, above the diagonal) and gene flow indices (Nm, below the diagonal) among six C. maculata populations

      变异来源
      Source of variation
      平方和
      Sum of squares
      变异组分
      Variance component
      变异百分比
      Variation percentage/
      %
      群体间 Among populations 460.645 1.347 32 15.18
      群体内 Within populations 2 796.240 7.529 68 84.82
      合计 Total 3 256.884 8.877 00

      表 8  6个斑鳢群体的AMOVA分析

      Table 8.  Analysis on molecular variance (AMOVA) of six C. maculata populations

    • 传统的微卫星分离技术主要包括小片段基因组DNA随机克隆法和磁珠富集法[15]。谢楠等[16]利用斑鳢EST序列发现8 439个SSR,SSR出现频率为19.03%;朱传坤等[17]利用磁珠富集法分离获得162个乌苏里拟鲿微卫星标记;曲妮妮等[18]利用FIASCO方法获得了479个合浦珠母贝微卫星标记。传统方法开发的微卫星标记虽然在一定程度上足够用于种群遗传多样性分析以及亲缘关系鉴定等工作,但不能满足遗传连锁图谱构建和特定基因定位等对分子标记需求量较大的研究需要。随着测序成本的降低,平台通量不断扩大,利用二代测序技术对基因组随机测序便可在短期内获得大量的微卫星序列[19]。Yuan等[20]对翘嘴鳜 (Siniperca chuatsi) 采用高通量测序,获得14 094个EST-SSR位点;李薇等[21]利用HiSeq 2500 高通量测序仪对达氏鲟 (Acipenser dabryanus) 基因组 DNA 进行随机测序,获得83 000多条SSR序列;孔啸兰等[22]对长体圆鲹 (Decapterus macrosoma) 进行高通量测序获得58 180个微卫星序列。而本研究利用HiSeq 2500高通量测序仪 (Illumina,USA) 进行全基因组测序,共获得355 297条斑鳢微卫星序列,这为筛选更多高多态性的微卫星标记及后续的资源养护、良种选育工作提供了重要保障。

      目前,微卫星用于评价群体的遗传多样性已有诸多报道,Olsen等[23]研究发现SSR比线粒体DNA能够更好地揭示阿拉斯加鲱形白鲑 (Coregonus clupeaformis) 种群的遗传结构;Norouzi和Pouekazemi[24]在利用SSR研究闪光鲟 (Acipenser stellatus) 中发现沿里海海岸线有不同的遗传群体存在;Min等[25]对淡水贻贝 (Lamprotula leai) 微卫星分析发现近交是影响其位点偏离Hardy-Weinberg平衡的关键因子;陈静等[26]利用10个微卫星位点在10个日本沼虾 (Macrobrachium Nipponense) 群体中检测到平均Na为23.9、平均Ho为0.65~0.72、平均He为0.79~0.88。与上述研究类似,本研究样本数量为28~41,采用20个微卫星位点进行群体分析,群体平均Na介于6.4~14.8、平均Ho为0.288~0.662,平均He为0.52~0.87,其中在斑鳢化州群体中共检测到296个NaHo为0.33~0.87,He为0.54~0.95,多态信息含量为0.51~0.94,说明本研究采用的方法可行有效。PIC是衡量微卫星位点多态性高低的指标,Boststein[27]提出划分标准,PIC>0.5时该位点具有高度多态性;0.25<PIC<0.5时,该位点具有中度多态性;PIC<0.25时,该位点为低度多态性。本研究中,6个斑鳢群体的20个微卫星位点多态信息含量为0.565 5~0.875 0,均高于0.5,表明本实验所选取的位点均属于高度多态性。同时,根据牛东红等[28]在2010年探究样本数量对遗传多样性指标的影响时指出,当样本数量大于30时遗传多样性指数趋于稳定,表明本研究选取的样本适用于斑鳢种群遗传多样性的分析,具有较高的可靠性。

      杂合度是度量群体遗传变异的最适参数[29],种群杂合度越高,表明该种群遗传多样性越高,群内变异越大[30-31],反之亦然。HoHe相差越多,表明该种群受自然灾害、种内近交以及人为破坏因素影响越大,群体处于遗传不平衡状态;反之,若两者相差越近则表明该种群处于遗传平衡。本研究中,6个斑鳢群体平均Ho均小于对应的He,这与武世雄等[32]关于大泷六线鱼 (Hexagrammos otakii) 遗传多样性的研究结果类似,表明用于本研究的6个野生斑鳢群体均处于遗传不平衡状态。同时,Hardy-Weinberg平衡偏离常数显示,有79.17%的基因座表现为极显著的遗传连锁不平衡,7.5%的基因座表现为显著的遗传不平衡,仅有13.33%的基因座表现为遗传平衡。这可能是由于斑鳢属于非洄游性鱼类,主要分布于水系上游以及湖泊水库等水域,存在近亲交配,且各种群之间相隔较远,因而基因交流减少,造成部分等位基因缺失,从而出现杂合子缺失的现象[33-34]。同时,本研究中斑鳢各群体Ne较少,这可能是由于生存环境的逐渐恶化,如水体污染以及人们的肆意捕捞和鱼类产卵场所遭破坏等原因,导致种群活动区域缩小,有效种群缩小,近交严重,有效等位基因丢失[35]

      目前,遗传分化系数FST被广泛应用于衡量群体间的遗传分化程度,按照Balloux和Lugon-moulin[36]在2002年提出的评判标准,FST<0.05时表示种群间分化程度弱;0.05<FST<0.15时表示分化程度中等;0.15<FST<0.25时表示分化程度较大;若FST>0.25,则表示分化程度极大。本研究中6个斑鳢群体间JH与其他5个群体间的FST值均大于0.15,且除与HZ群体小于0.25外,与另外4个群体间FST值均大于0.25,属于表示江华群体与其他群体分化程度极大;广州、化州、南宁、阳江、邵武群体间的FST值均介于0.05~0.15,属于中等分化程度。AMOVA分析结果表明,6个群体遗传变异主要来源于群体内 (84.82%),来源于群体间的变异为15.18%。本研究认为造成这种现象的原因可能是由于群体处于不同自然环境下,当地气候[37]、水体环境[38]、河流底泥营养成分[39]和底层微生物[40]等均不同,这些因子会直接或者间接地影响种群中某些基因的表达,进而引起种群波动和生态特征的变化。

      本研究结果显示,HZ、YJ和SW 3个群体间遗传距离最近,在聚类分化时首先聚为一支,随后与NN、GZ 群体聚为一支;JH群体与其他5个群体间的遗传距离均较远,最后JH群体才与它们聚为一支。本文分析JH与其他种群遗传距离远,分化程度大的原因可能是JH群体的环境因子,如温度、盐度、饵料和底质等与其他群体不同[41],也可能是由于JH群体生活的环境相对较封闭,与其他种群的基因交流较少[42];湖南既有斑鳢也有乌鳢自然分布,属于由南到北,由斑鳢向乌鳢转变的过渡区[43],在自然条件下可能存在基因交流,杂交鳢的遗传距离与斑鳢间的遗传距离较斑鳢种群内部更远[44],这也可能是JH群体分化程度大的原因。NN与GZ群体遗传距离较近,推测是因为NN与GZ虽然分别属于西江与北江,但都属于珠江流域河流,为天然地理群体的基因交流提供了机会[45],NN与GZ间的Nm值为1.624 5 (Nm是评估种群间基因交流的参数,Nm>1,表示基因交流水平较高) 也佐证了这一点。同时,杂交鳢可育,在养殖或流通过程中有可能逃逸到自然水体,从而造成野生群体的混杂。

    • 本研究通过对斑鳢基因组进行高通量测序,获得了355 297条微卫星序列,与传统方法相比具有明显优势,将成为微卫星开发的主要手段之一。利用筛选的20个高多态性微卫星标记对花都、化州、江华、南宁、阳江和邵武6个斑鳢群体进行遗传多样性分析;结果表明,6个群体均有较高的遗传多样性,且种群间存在中等或高度分化状况。本研究为斑鳢种群管理、养殖亲本遗传改良奠定了基础。

参考文献 (45)

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