留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

TGF-β/Smad信号通路响应光周期变化参与调控斑马鱼卵巢发育

刘春晓 吕为群 杨志刚 陈阿琴

引用本文:
Citation:

TGF-β/Smad信号通路响应光周期变化参与调控斑马鱼卵巢发育

    作者简介: 刘春晓(1994—),女,硕士研究生,从事水产动物分子生物学研究。E-mail: 1426841828@qq.com;
    通讯作者: 陈阿琴, aqchen@shou.edu.cn
  • 中图分类号: S917.4

TGF-β/Smad signaling pathway responding to photoperiod for participation in regulation of zebrafish ovarian development

    Corresponding author: Aqin CHEN, aqchen@shou.edu.cn
  • CLC number: S917.4

  • 摘要: 为研究不同光周期条件下转化生长因子-β超家族/Samd (TGF-β/Smad)信号通路在斑马鱼 (Danio rerio)卵巢中的作用,利用荧光定量PCR技术检测连续黑暗 (0 L∶24 D, DD)、自然光照 (14 L∶10 D, LD)和连续光照 (24 L∶0 D, LL)条件下斑马鱼卵巢中TGF-β/Smad信号通路中相关基因的相对表达量,并利用免疫组化技术检测不同光周期条件下p-Smad2在斑马鱼卵巢中的定位情况。结果显示,在不同光周期条件下,TGF-β/Smad信号通路中信号分子在斑马鱼卵巢中的表达模式不尽相同,其中配体 (tgfb3)、受体 (tgfbr2atgfbr2btgfbr1b)和下游蛋白激酶 (smad2和smad3a)的表达趋势一致,即在不同光周期处理3 d后,上述6个基因的相对表达量DD组最高,LL组最低,但处理7 d后则呈相反趋势。在斑马鱼卵黄发生前期至充分生长未成熟期的卵母细胞中均检测到p-Smad2蛋白信号,但光周期处理后未影响p-Samd2在斑马鱼卵巢中的定位。结果表明,光周期变化可能通过改变 tgfb3/受体/蛋白激酶基因的表达模式影响斑马鱼的卵巢发育。
  • 图 1  不同光周期处理对斑马鱼卵巢中tgfb1a (a)、tgfb1b (b)、tgfb2 (c)和tgfb3 (d) mRNA表达的影响

    Figure 1.  Effects of different photoperiods on ovarian tgfb1a (a), tgfb1b (b), tgfb2 (c) and tgfb3 (d) mRNA levels in zebrafish

    图 2  不同光周期处理对斑马鱼卵巢中tgfbr2a (a)、tgfbr2b (b)、tgfbr1a (c)和tgfbr1b (d) mRNA表达的影响

    Figure 2.  Effects of different photoperiods on ovarian tgfbr2a (a), tgfbr2b (b), tgfbr1a (c) and tgfbr1b (d) mRNA expression levels in zebrafish

    图 3  不同光周期处理对斑马鱼卵巢中smad2 (a)、smad3a (b) 和smad3b (c) mRNA表达的影响

    Figure 3.  Effects of different photoperiods on ovary smad2 (a), smad3a (b) and smad3b (c) mRNA levels in zebrafish

    图 4  不同光周期处理对p-Smad2在斑马鱼卵巢中定位的影响

    Figure 4.  Effects of different photoperiods on localization of p-Smad2 in zebrafish ovary

    表 1  实时荧光定量PCR所用引物序列

    Table 1.  Primer sequences used for quantitative real-time PCR

    基因
    gene
    引物序列 (5'−3')
    primer sequence
    GenBank登录号
    GenBank accession No.
    ef1a[16]F: GGCTGACTGTGCTGTGCTGATTGNM_131263
    R: CAGACTTGTGGCAGGTGTAA
    tgfb1aF: TGTACCCGCAATCCTTGACCNM_182873.1
    R: CCGACTGAGAAATCGAGCCA
    tgfb1bF: ATAGCAGGTTTGTCCCGCAAXM_687246.8
    R: ATAGGAGCAAGAGCCAGTGC
    tgfb2F: CAACAGCAAAGTGGTTCGCANM_194385.1
    R: AATGTGGAGACTGACCGCTG
    tgfb3F: GGACCGAGCAGAGAATCGAGNM_194386.2
    R: CGTCGAAGGAAACCCACTCA
    tgfbr2aF: ATGTCTGCTCTTCTCCGCACXM_009293931.3
    R: AGCATCGGCTTTAGTGGGTC
    tgfbr2bF: TCACGTCCAGATGTAACGCCNM_182855.3
    R: CAGTTTGTCCAGGTCGTCGT
    tgfbr1aF: GTGTCAATCGGTCGTGCAACNM_001037683.2
    R: CACACAGATGGGGACAGCAA
    tgfbr1bF: GAGTCGGCACCAAACGGTATNM_001115059.1
    R: CTGCCATCTGTTGGGGATGT
    smad2F: AAGTCTGCGTCAATCCCTACCACTNM_001290015.1
    R: TAGTCGTCCAAAGGTGGCAACTCA
    smad3aF: CAAACCTGTCACCGAACCCTNM_131571.2
    R: GCAGTCCGAGACAAAAACGC
    smad3bF: TGGACACAGGTTCTCCAACGNM_175083.2
    R: TGGAAAGTCTCACCGACACG
    下载: 导出CSV
  • [1] ARTIGAS G Q, LAPEBIE P, LECLERE L A, et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia[J]. Elife, 2018, 7: e29555. doi: 10.7554/eLife.29555
    [2] SOKOLOWSKA E, KLESZCZYNSKA A, NIETRZEBA M, et al. Annual changes in brain concentration of arginine vasotocin and isotocin correspond with phases of reproductive cycle in round goby, Neogobius melanostomus[J]. Chronobiol Int, 2015, 32(7): 917-924. doi: 10.3109/07420528.2015.1052142
    [3] HANSEN T J, FJELLDAL P G, FOLKEDAL O, et al. Effects of light source and intensity on sexual maturation, growth and swimming behaviour of Atlantic salmon in sea cages[J]. Aquacult Env Interac, 2017, 9: 193-204. doi: 10.3354/aei00224
    [4] TARANGER G L, AARDAL L, HANSEN T, et al. Continuous light delays sexual maturation and increases growth of Atlantic cod (Gadus morhua L.) in sea cages[J]. ICES J Mar Sci, 2006, 63(2): 365-375. doi: 10.1016/j.icesjms.2005.10.014
    [5] LEE C H, PARK Y J, LEE Y D. Effects of photoperiod manipulation on gonadal activity of the damselfish, Chromis notata[J]. Dev Reprod, 2017, 21(2): 223-228. doi: 10.12717/DR.2017.21.2.223
    [6] TAKEUCHI Y, HADA N, IMAMURA S, et al. Existence of a photoinducible phase for ovarian development and photoperiod-related alteration of clock gene expression in a damselfish[J]. Comp Biochem Physiol A, 2015, 188: 32-39. doi: 10.1016/j.cbpa.2015.06.010
    [7] PARMEGGIANI A, GOVONI N, ZANNONI A, et al. Effect of photoperiod on endocrine profiles and vitellogenin expression in European eels Anguilla anguilla during artificially induced ovarian development[J]. Theriogenology, 2015, 83(4): 478-484. doi: 10.1016/j.theriogenology.2014.10.008
    [8] IMSLAND A K, JONASSEN T M, HANGSTAD T A, et al. The effect of continuous light and compressed photoperiods on growth and maturation in lumpfish Cyclopterus lumpus[J]. Aquaculture, 2018, 485: 166-172. doi: 10.1016/j.aquaculture.2017.11.053
    [9] LUO K X. Signaling cross talk between TGF-beta/Smad and other signaling pathways[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2017, 9(1): a022137. doi: 10.1101/cshperspect.a022137
    [10] 詹绪良, 吴金英, 李文笙. TGF-β系统及其在硬骨鱼中的研究进展[J]. 南方水产科学, 2013, 9(3): 90-96. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2013.03.015
    [11] ZHU B, PARDESHI L, CHEN Y Y, et al. Transcriptomic analysis for differentially expressed genes in ovarian follicle activation in the zebrafish[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2018, 9: 593. doi: 10.3389/fendo.2018.00593
    [12] KOHLI G, HU S Q, CLELLAND E, et al. Cloning of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and its type II receptor from zebrafish ovary and role of TGF-β1 in oocyte maturation[J]. Endocrinology, 2003, 144(5): 1931-1941. doi: 10.1210/en.2002-0126
    [13] KOHLI G, CLELLAND E, PENG C. Potential targets of transforming growth factor-beta1 during inhibition of oocyte maturation in zebrafish[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2005, 3: 53. doi: 10.1186/1477-7827-3-53
    [14] SLOIN H E, RUGGIERO G, RUBINSTEIN A, et al. Interactions between the circadian clock and TGF-β signaling pathway in zebrafish[J]. PLoS One, 2018, 13(6): e0199777. doi: 10.1371/journal.pone.0199777
    [15] GAST H, GORDIC S, PETRZILKA S, et al. Transforming growth factor-beta inhibits the expression of clock genes[J]. Ann NY Acad Sci, 2012, 1261(1): 79-87. doi: 10.1111/nyas.2012.1261.issue-1
    [16] LIU K C, LIN S W, GE W. Differential regulation of gonadotropin receptors (fshr and lhcgr) by estradiol in the zebrafish ovary involves nuclear estrogen receptors that are likely located on the plasma membrane[J]. Endocrinology, 2011, 152(11): 4418-4430. doi: 10.1210/en.2011-1065
    [17] SELMAN K, WALLACE R A, SARKA A, et al. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio[J]. J Morphol, 1993, 218(2): 203-224. doi: 10.1002/(ISSN)1097-4687
    [18] WANG Y, GE W. Developmental profiles of activin betaA, betaB, and follistatin expression in the zebrafish ovary: evidence for their differential roles during sexual maturation and ovulatory cycle[J]. Biol Reprod, 2004, 71(6): 2056-2064. doi: 10.1095/biolreprod.104.032649
    [19] CHU Y L, XU Y R, YANG W X, et al. The role of FSH and TGF-β superfamily in follicle atresia[J]. Aging, 2018, 10(3): 305-321. doi: 10.18632/aging.v10i3
    [20] WANG D, WANG W, LIANG Q, et al. DHEA-induced ovarian hyperfibrosis is mediated by TGF-β signaling pathway[J]. J Ovarian Res, 2018, 11(1): 6. doi: 10.1186/s13048-017-0375-7
    [21] BASU M, BHATTACHARYA R, RAY U, et al. Invasion of ovarian cancer cells is induced by PITX2-mediated activation of TGF-β and Activin-A[J]. Mol Cancer, 2015, 14(1): 162. doi: 10.1186/s12943-015-0433-y
    [22] HATZIRODOS N, BAYNE R A, IRVING-RODGERS H F, et al. Linkage of regulators of TGF-β activity in the fetal ovary to polycystic ovary syndrome[J]. FASEB J, 2011, 25(7): 2256-2265. doi: 10.1096/fj.11-181099
    [23] KNIGHT P G, GLISTER C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development[J]. Reproduction, 2006, 132(2): 191-206. doi: 10.1530/rep.1.01074
    [24] ROSAIRO D, KUYZNIEREWICZ I, FINDLAY J A. Transforming growth factor-beta: its role in ovarian follicle development[J]. Reproduction, 2008, 136(6): 799-809. doi: 10.1530/REP-08-0310
    [25] LIU X, ANDOH K, ABE Y, et al. A comparative study on transforming growth factor-beta and activin A for preantral follicles from adult, immature, and diethylstilbestrol-primed immature mice[J]. Endocrinology, 1999, 140(6): 2480-2485. doi: 10.1210/endo.140.6.6827
    [26] HELDIN C H, MOUSTAKAS A. Signaling receptors for TGF-β family members[J]. CSH Perspect Biol, 2016, 8(8): a022053.
    [27] TAN Q, BALOFSKY A, WEISZ K, et al. Role of activin, transforming growth factor-β and bone morphogenetic protein 15 in regulating zebrafish oocyte maturation[J]. Comp Biochem Physiol A, 2009, 153(1): 18-23.
    [28] CHEN W T, LIU L, GE W. Expression analysis of growth differentiation factor 9 (Gdf9/gdf9), anti-müllerian hormone (Amh/amh) and aromatase (Cyp19a1a/cyp19a1a) during gonadal differentiation of the zebrafish, Danio rerio[J]. Biol Reprod, 2017, 96(2): 401-413. doi: 10.1095/biolreprod.116.144964
    [29] ITOH S, TEN DIJKE P. Negative regulation of TGF-β receptor/Smad signal transduction[J]. Curr Opin Cell Biol, 2007, 19(2): 176-184. doi: 10.1016/j.ceb.2007.02.015
    [30] MIYAZAWA K, MIYAZONO K. Regulation of TGF-β family signaling by inhibitory smads[J]. Cold Spring Harbor Perspect Biol, 2016, 9(3): a022095.
    [31] DONG C M, LI Z R, ALVAREZ R, et al. Microtubule binding to smads may regulate TGFβ activity[J]. Mol Cell, 2000(5): 27-34.
    [32] WANG Y, GE W. Spatial expression patterns of activin and its signaling system in the zebrafish ovarian follicle: evidence for paracrine action of activin on the oocytes[J]. Biol Reprod, 2003, 69(6): 1998-2006. doi: 10.1095/biolreprod.103.020826
  • [1] 郭松傅明骏赵超李伟杰江世贵杨其彬周发林邱丽华 . 斑节对虾细胞周期蛋白T基因的克隆和表达分析. 南方水产科学, 2016, 12(1): 59-66. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.01.009
    [2] 李运彩张松林白芳铭赵国庆陈粉丽 . 氯代苯和烷基酚类化合物斑马鱼毒性的定量构效关系分析. 南方水产科学, 2010, 6(3): 19-23. doi: 10.3969/j.issn.1673-2227.2010.03.004
    [3] 吴松唐蕾傅明骏杨丽诗黄建华周发林江世贵 . 斑节对虾泛素融合蛋白UbS27基因克隆与表达分析. 南方水产科学, 2016, 12(1): 77-84. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.01.011
    [4] 黄桂菊喻达辉郭奕惠王小玉 . 大豆异黄酮对鱼类免疫增强作用的初步研究. 南方水产科学, 2005, 1(2): 35-40.
    [5] 戴文婷傅明骏赵超周发林杨其彬王艳史进选邱丽华 . 斑节对虾CDK2基因全长cDNA克隆及表达分析. 南方水产科学, 2015, 11(2): 1-11. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.02.001
    [6] 傅明骏赵超周发林邱丽华江世贵 . 斑节对虾泛素结合酶PmUbc基因的克隆及表达分析. 南方水产科学, 2015, 11(6): 41-48. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.06.006
    [7] 赵旺杨其彬陈旭陈明强温为庚 . 猛虾蛄卵巢发育特征及其纳精囊内容物超显微观察. 南方水产科学, 2019, 15(2): 121-126. doi: 10.12131/20180119
    [8] 周发林黄建华邱丽华杨其彬江世贵 . 斑节对虾细胞周期蛋白B慢病毒载体的构建及对Hela 细胞增殖影响. 南方水产科学, 2014, 10(4): 16-21. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.04.003
    [9] 温为庚林黑着牛津黄建华杨其彬江世贵 . 野生斑节对虾卵巢发育过程中不同组织的氨基酸组成. 南方水产科学, 2013, 9(5): 32-36. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2013.05.005
    [10] 韩萍杨丽诗吴松杨其彬黄建华周发林江世贵 . 促性腺激素释放激素及多巴胺拮抗物地欧酮对斑节对虾卵巢组织发育的影响. 南方水产科学, 2015, 11(2): 50-56. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.02.007
    [11] 蔡瑞钰赵健蓉黄静王志坚苏胜齐 . 云南盘鳇仔稚鱼发育的初步观察. 南方水产科学, 2018, 14(3): 120-125. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.03.015
    [12] 孙庆海施维德孙建璋 . 鮸鱼早期发育的形态学初步研究. 南方水产科学, 2005, 1(6): 8-17.
    [13] 黄小林李涛林黑着杨育凯虞为黄忠 . 网箱养殖黄斑篮子鱼胚胎发育观察. 南方水产科学, 2018, 14(2): 96-101. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.02.013
    [14] 杨洋陈瑶万玉芳邓思红何学福王志坚金丽 . 短须裂腹鱼与鲈鲤杂交F1代胚胎及仔稚鱼发育观察. 南方水产科学, 2018, 14(6): 66-73. doi: 10.12131/20180075
    [15] 马学坤柳学周温海深张璐 . 漠斑牙鲆胚胎及仔稚鱼发育的形态学观察. 南方水产科学, 2008, 4(1): 41-47.
    [16] 苏天凤江世贵 . 竹筴鱼属鱼类线粒体DNA控制区结构及其系统发育分析. 南方水产科学, 2011, 7(1): 18-25. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2011.01.003
    [17] 柴学军孙敏许源剑 . 温度和盐度对日本黄姑鱼胚胎发育的影响. 南方水产科学, 2011, 7(5): 43-49. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2011.05.007
    [18] 龙华王祖荣 . 15种鱼转铁蛋白cDNA序列密码子使用比较分析. 南方水产科学, 2005, 1(1): 6-10.
    [19] 陈子桂肖述潘英喻子牛 . 近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)家系早期发育生长比较. 南方水产科学, 2011, 7(6): 40-46. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2011.06.007
    [20] 彭文姜敬哲王江勇丁雪娟 , . 理化因子对杂色鲍血蓝蛋白酚氧化酶活性影响的研究. 南方水产科学, 2010, 6(2): 1-6. doi: 10.3969/j.issn.1673-2227.2010.02.001
  • 加载中
图(4)表(1)
计量
  • 文章访问数:  1282
  • HTML全文浏览量:  504
  • PDF下载量:  22
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2018-12-20
  • 录用日期:  2019-01-16
  • 网络出版日期:  2019-02-18
  • 刊出日期:  2019-06-01

TGF-β/Smad信号通路响应光周期变化参与调控斑马鱼卵巢发育

    作者简介:刘春晓(1994—),女,硕士研究生,从事水产动物分子生物学研究。E-mail: 1426841828@qq.com
    通讯作者: 陈阿琴, aqchen@shou.edu.cn
  • 1. 海洋生物科学国际联合研究中心 (上海海洋大学),中国科学技术部,上海 201306
  • 2. 水产科学国家级实验教学示范中心 (上海海洋大学),上海 201306
  • 3. 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室 (上海海洋大学),上海 201306

摘要: 为研究不同光周期条件下转化生长因子-β超家族/Samd (TGF-β/Smad)信号通路在斑马鱼 (Danio rerio)卵巢中的作用,利用荧光定量PCR技术检测连续黑暗 (0 L∶24 D, DD)、自然光照 (14 L∶10 D, LD)和连续光照 (24 L∶0 D, LL)条件下斑马鱼卵巢中TGF-β/Smad信号通路中相关基因的相对表达量,并利用免疫组化技术检测不同光周期条件下p-Smad2在斑马鱼卵巢中的定位情况。结果显示,在不同光周期条件下,TGF-β/Smad信号通路中信号分子在斑马鱼卵巢中的表达模式不尽相同,其中配体 (tgfb3)、受体 (tgfbr2atgfbr2btgfbr1b)和下游蛋白激酶 (smad2和smad3a)的表达趋势一致,即在不同光周期处理3 d后,上述6个基因的相对表达量DD组最高,LL组最低,但处理7 d后则呈相反趋势。在斑马鱼卵黄发生前期至充分生长未成熟期的卵母细胞中均检测到p-Smad2蛋白信号,但光周期处理后未影响p-Samd2在斑马鱼卵巢中的定位。结果表明,光周期变化可能通过改变 tgfb3/受体/蛋白激酶基因的表达模式影响斑马鱼的卵巢发育。

English Abstract

  • 光照是动物生存的重要环境因子之一,能够直接或间接地影响动物自身的生长、摄食、繁殖等生理活动。在自然环境中,动物以黎明或黄昏时的光线变化作为每日可靠的线索来调节个体之间的繁殖行为[1];硬骨鱼类和其他季节性繁殖动物一样,其繁殖周期与环境光周期变化同步[2]。在实验室条件下,研究者已经成功利用改变光照时间对众多鱼类进行生殖调控,主要包括大西洋鳕 (Gadus morhua)[3-4]、雀鲷 (Chrysiptera cyanea)[5-6]、欧洲鳗鲡 (Anguilla anguilla)[7]、浪浦斯鱼 (Cyclopterus lumpus)[8]等,极大地提高了其繁殖力和经济价值。

    转化生长因子-β (transforming growth factor,TGF-β)是TGF-β超家族的重要成员之一,在细胞增殖、分化、迁移、凋亡等多种生理过程中发挥着重要作用[9]。目前,在硬骨鱼类中已被发现的TGF-β异构体有4种,分别是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β6[10]。在斑马鱼 (Danio rerio)中发现,TGF-β在初级生长期卵母细胞向卵黄发生前期卵母细胞转变过程中发挥着重要作用[11];此外,TGF-β1能够抑制17α,20β-双羟孕酮 (17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one 17α,20β-DHP)、人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin,HCG)和成熟诱导激素(maturation-inducing hormone,MIH)诱导卵母细胞成熟[12-13]。近年来研究证实,TGF-β信号通路与生物钟存在交互影响,TGF-β抑制剂 (LY-364947)能够浓度依赖性地延迟斑马鱼per1b基因的表达[14-15],提示TGF-β信号通路受光信号调控。但到目前为止,TGF-β信号通路是否响应光周期参与调控硬骨鱼类卵巢发育的研究尚未见报道。

    因此,本研究检测了不同光周期条件下TGF-β家族的3个配体 (tgfb1atgfb1btgfb2和tgfb3)、2个受体 (tgfbr2atgfbr2btgfbr1atgfbr1b)和2个下游蛋白激酶 (smad2、smad3asmad3b) 共11个基因在斑马鱼卵巢发育过程中的表达变化,以及p-Smad2在斑马鱼卵巢中的定位情况,探讨不同光周期胁迫下TGF-β/Smad信号通路对斑马鱼卵巢发育的调控作用,为进一步阐明光周期对硬骨鱼类卵巢发育机制的影响和实际生产提供理论参考依据。

    • 实验所需野生型雌性斑马鱼 (4~5月龄)于2018年3月6日购自上海佳誉水族馆,体质量为 (0.58±0.05) g·尾–1,体长为(3.05±0.03) cm·尾–1,共90尾。实验前于上海海洋大学适应生理学实验室自动循环水养殖系统中暂养30 d,水温28~29 ℃,溶氧6~8 mg·L–1,氨态氮0.08~0.10 mg·L–1,pH 7.5~7.7,光暗周期14 h光照 (L)∶10 h黑暗 (D)。暂养期间每天投喂2 次丰年虫,24 h不间断进行水循环。暂养结束后每隔7 d按雌雄比1∶2交配1次,规律交配4~5次后进行实验。

      RNAiso Plus和反转录试剂盒 (PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser)购自TaKaRa公司 (美国),荧光定量试剂盒(QuantiNovaTM SYBR Green PCR Kit)购自QIAGAN公司 (德国),OCT包埋剂购自Sakura Americas公司 (美国),p-Smad2抗体购自CST公司 (美国)。

    • 正式实验的前一晚 (2018年5月10日),挑选健康、体型均匀的斑马鱼按雌雄比1∶2放入产卵缸中,并将雌雄鱼用隔板隔开,产卵缸规格为115 mm×280 mm×160 mm,有效水体积3 L。第二天早晨开灯0.5 h后将隔板抽出,雌雄斑马鱼进行交配,当天晚上22:00正式开始实验。将雌性斑马鱼分别置于全光照 (24 L∶0 D,LL)、自然光照 (14 L∶10 D,LD)、全黑暗 (0 L∶24 D,DD) 3种不同的光周期环境中,实验组和对照组均为3个平行,每个平行组8尾鱼,每组共计24尾鱼。实验期间正常投喂、换水,光照强度为300 lx,室温28 ℃。在光周期处理后的第3和第7天进行取样,分别在3个平行组中随机选择6尾鱼解剖取卵巢用于RNA提取,另随机取3尾鱼解剖取卵巢用于组织切片。

    • 参照RNAiso plus的说明书对获得的卵巢样品提取总RNA,利用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测提取总RNA的完整性、纯度和浓度。以上述总RNA为模板,按照反转录试剂盒步骤进行反转录合成cDNA。所有cDNA模板稀释10倍后于−40 ℃保存备用。

    • 以上述cDNA稀释液为模板,依照荧光定量试剂盒说明书将样品置于ABI 7500 Real Time PCR仪中进行定量分析,荧光定量PCR实验所需引物见表1。反应体系为2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,QN ROX Reference Dye 0.1 μL,RNase-free water 6.9 μL,10 μmol·L–1上、下游引物各0.5 μL,cDNA 模板稀释液2 μL。反应条件为95 ℃,2 min;95 ℃,5 s;60 ℃,40 s,40个循环。以ef1a为内参基因,采用2–ΔΔCT方法计算目的基因的mRNA相对表达量。

      基因
      gene
      引物序列 (5'−3')
      primer sequence
      GenBank登录号
      GenBank accession No.
      ef1a[16]F: GGCTGACTGTGCTGTGCTGATTGNM_131263
      R: CAGACTTGTGGCAGGTGTAA
      tgfb1aF: TGTACCCGCAATCCTTGACCNM_182873.1
      R: CCGACTGAGAAATCGAGCCA
      tgfb1bF: ATAGCAGGTTTGTCCCGCAAXM_687246.8
      R: ATAGGAGCAAGAGCCAGTGC
      tgfb2F: CAACAGCAAAGTGGTTCGCANM_194385.1
      R: AATGTGGAGACTGACCGCTG
      tgfb3F: GGACCGAGCAGAGAATCGAGNM_194386.2
      R: CGTCGAAGGAAACCCACTCA
      tgfbr2aF: ATGTCTGCTCTTCTCCGCACXM_009293931.3
      R: AGCATCGGCTTTAGTGGGTC
      tgfbr2bF: TCACGTCCAGATGTAACGCCNM_182855.3
      R: CAGTTTGTCCAGGTCGTCGT
      tgfbr1aF: GTGTCAATCGGTCGTGCAACNM_001037683.2
      R: CACACAGATGGGGACAGCAA
      tgfbr1bF: GAGTCGGCACCAAACGGTATNM_001115059.1
      R: CTGCCATCTGTTGGGGATGT
      smad2F: AAGTCTGCGTCAATCCCTACCACTNM_001290015.1
      R: TAGTCGTCCAAAGGTGGCAACTCA
      smad3aF: CAAACCTGTCACCGAACCCTNM_131571.2
      R: GCAGTCCGAGACAAAAACGC
      smad3bF: TGGACACAGGTTCTCCAACGNM_175083.2
      R: TGGAAAGTCTCACCGACACG

      表 1  实时荧光定量PCR所用引物序列

      Table 1.  Primer sequences used for quantitative real-time PCR

    • 斑马鱼卵巢于4%多聚甲醛4 ℃固定过夜,经20%蔗糖、30%蔗糖梯度脱水后用OCT包埋剂包埋,待组织沉降到模具底部且无气泡时于冰冻切片机上切片 (8 μm)。切片经水化后用3%过氧化氢(H2O2)消除过氧化物酶活性,用10%牛血清室温封闭30 min, p-Smad2 (1∶200) 4 ℃孵育过夜,加入相应二抗37 ℃孵育45 min,DAB显色后用苏木精复染30 s,脱水、透明、中性树脂封片。每个切片样本均设置阴性对照组,阴性对照组中使用PBS代替一抗,其余操作步骤与实验组一致。

    • 按照Selman等[17]、Huang和Ge[18]的分期标准,将斑马鱼卵母细胞分为5个时期:初级生长期 (primary growth stage, PG, ~0.15 mm);卵黄发生前期 (previtellogenic stage, PV, ~0.25 mm);卵黄发生早期 (early vitellogenic stage, EV, ~0.35 mm);卵黄发生中期 (midvitellogenic stage, MV, ~0.45 mm);充分生长未成熟期 (full-grown immature stage, FG, ~0.65 mm)。

    • 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析,利用单因素方差分析对同一时间点不同光照条件的实验结果进行差异显著性分析,利用独立样本t检验对同一光照条件不同时间点的实验结果进行差异显著性分析,P<0.05为显著差异。实验所得数据均以“平均值±标准误 ($\overline {{X}}\pm {\rm SE} $)”表示,应用软件GraphPad Prism 6作图。

    • 不同光周期条件下tgfb1atgfb2、tgfb3 相对表达量在斑马鱼卵巢中变化趋势不一致。不同光周期处理3 d后,tgfb1a mRNA在斑马鱼卵巢中的表达水平随着光照时间的延长呈现增高趋势,但组间无显著差异 (图1-a);而tgfb3则呈现相反结果 (图1-c);LL和DD处理均降低了tgfb2 mRNA的表达 (图1-b)。不同光周期处理7 d后,tgfb1a mRNA表达趋势与处理3 d的一致 (图1-a);DD和LL处理增加了tgfb2 mRNA的表达,但与LD组相比无显著差异 (图1-b);与LD组相比,LL组tgfb3 mRNA表达显著增加 (P<0.05),但DD组变化不显著 (图1-c)。与不同光周期处理3 d时相比,不同光周期处理7 d后,tgfb1atgfb1btgfb2和tgfb3的表达在实验组和对照组中均无显著差异。

      图  1  不同光周期处理对斑马鱼卵巢中tgfb1a (a)、tgfb1b (b)、tgfb2 (c)和tgfb3 (d) mRNA表达的影响

      Figure 1.  Effects of different photoperiods on ovarian tgfb1a (a), tgfb1b (b), tgfb2 (c) and tgfb3 (d) mRNA levels in zebrafish

    • 不同光周期对斑马鱼卵巢中TGF-β 4种受体mRNA表达的影响见图2。结果显示,不同光周期处理3 d后,DD处理均增加了tgfbr2atgfbr2btgfbr1atgfbr1b mRNA表达量,且DD组tgfbr2atgfbr1b的表达显著高于LL组 (P<0.05),但tgfbr2btgfbr1a 表达变化不显著 (图2)。不同光周期处理7 d后,与LD组相比,tgfbr2atgfbr2btgfbr1b mRNA在LL组中的表达显著升高 (图2-a、b、d);而tgfbr1a在DD组中的表达显著高于LD组 (P<0.05,图2-c)。与不同光周期处理3 d时相比,连续黑暗处理7 d后,tgfbr2atgfbr1b表达量显著降低 (P<0.05,图2-a、d);自然光照处理7 d后,tgfbr2a表达量显著降低 (P<0.05,图2-a);连续光照处理7 d后tgfbr1b表达量显著增加 (P<0.05,图2-d)。

      图  2  不同光周期处理对斑马鱼卵巢中tgfbr2a (a)、tgfbr2b (b)、tgfbr1a (c)和tgfbr1b (d) mRNA表达的影响

      Figure 2.  Effects of different photoperiods on ovarian tgfbr2a (a), tgfbr2b (b), tgfbr1a (c) and tgfbr1b (d) mRNA expression levels in zebrafish

    • 不同光周期处理3 d后,随着光照时间的延长smad2和smad3b在斑马鱼卵巢中的表达呈降低趋势 (图3-a、c),且DD组smad2 mRNA表达水平显著高于LL组 (P<0.05),但smad3b在各组中表达无显著差异;smad3a的表达在3个光周期处理组间无明显波动 (图3-b)。不同光周期处理7 d后,LL组smad2 mRNA表达水平显著高于DD组和LD组 (P<0.05),但DD组和LD组之间无显著差异;smad3asmad3b mRNA表达在3个处理组间均无显著差异。与不同光周期处理3 d时相比,不同光周期处理7 d后,DD组和LD组中smad2 mRNA表达量显著降低 (P<0.05,图3-a)。

      图  3  不同光周期处理对斑马鱼卵巢中smad2 (a)、smad3a (b) 和smad3b (c) mRNA表达的影响

      Figure 3.  Effects of different photoperiods on ovary smad2 (a), smad3a (b) and smad3b (c) mRNA levels in zebrafish

    • 在不同发育时期的斑马鱼卵母细胞内均检测到激活的Smad2信号(图4)。LD组中p-Smad2在斑马鱼PV期卵母细胞中被激活,且主要集中在核区;EV期p-Smad2开始向细胞质迁移;MV期卵母细胞的细胞质和细胞核中均检测到p-Smad2表达;FG期时,在卵母细胞的细胞质、细胞膜上均检测到较强的p-Smad2信号,滤泡细胞中检测到p-Smad2的弱表达,但在细胞核中无表达。不同的光周期处理并未改变p-Smad2在斑马鱼卵巢中的定位,DD和LL组检测到活化的Smad2的表达位置与LD组一致。阴性对照组未检测到p-Smad2阳性信号。

      图  4  不同光周期处理对p-Smad2在斑马鱼卵巢中定位的影响

      Figure 4.  Effects of different photoperiods on localization of p-Smad2 in zebrafish ovary

    • 哺乳动物中,TGF-β/Smad信号通路与卵巢发育存在密切关系[19-23],但在硬骨鱼类中的研究相对较少且分散。此外,光周期变化是否通过TGF-β/Smad信号通路影响硬骨鱼类的卵巢发育也尚未探明。本研究发现,在不同光周期条件下,TGF-β信号通路中的相关基因表达会发生变化,所涉及的基因表达趋势和变化幅度不尽相同,提示不同的配体、受体以及细胞内信号传递蛋白在响应光周期调控斑马鱼卵巢发育过程中可能发挥着不同功能。

      TGF-β在卵巢中的功能随物种不同而存在差异。TGF-β可抑制大鼠 (Rattus norvegicus)腔前卵泡发育[24],但促进小鼠 (Mus musculus) 腔前卵泡发育[25]。TGF-β的不同配体在同一物种不同卵巢发育阶段中发挥的功能也不同。tgfb1 mRNA表达量在出生第12天的大鼠卵巢中达到峰值,但此时卵巢中tgfb2和tgfb3的表达量显著低于第4天和第25天[24]。相较于哺乳动物,TGF-β在鱼类卵巢功能上的研究明显不足,研究表明,tgfb1在斑马鱼PG和PV期卵母细胞中表达量最高,随着卵母细胞的发育,其表达量逐渐降低,在卵母细胞成熟时降至极低水平[26]。本研究结果显示,不同光周期处理7 d后,tgfb1atgfb3 mRNA表达量均在持续光照条件下最高,推测可能是因为LL处理延后了斑马鱼的卵巢发育,卵巢中PV和PG期卵母细胞比例增多,这符合已有的研究结果[12]。此外,tgfb1btgfb2在不同光周期处理后表达趋势与tgfb1atgfb3不一致,提示TGF-β不同配体单独或联合参与调控鱼类卵巢发育,且可能具有阶段特异性,在今后的研究中需深入阐明其作用机制。

      TGF-β通过经典的TGF-βRII/TGF-βRI-Smad2/3信号通路发挥其生物学功能[26]。本研究表明,在不同光周期处理3 d后,tgfbr2atgfbr2btgfbr1bsmad2及smad3a的相对表达量,在DD组最高,在LL组最低,但处理7 d后则呈相反趋势,此结果与不同光周期处理下tgfb3在斑马鱼卵巢中的表达模式一致。这表明光周期变化通过改变tgfb3/受体 (tgfbr2atgfbr2btgfbr1b)/蛋白激酶 (smad2和smad3a)基因的表达量影响斑马鱼卵巢的发育。同时,本研究也揭示了TGF-β3在硬骨鱼类生殖方面发挥着重要功能,这将为硬骨鱼类卵巢发育研究提供一个新的思路。不同光周期处理下tgfbr1asmad3b 在斑马鱼卵巢中的表达趋势与上述基因不一致,提示Smad2/3蛋白除了受TGF-β信号通路介导外,TGF-β超家族中的其他成员,例如激活素[27]和生长分化因子-9 (growth differentiation factor-9, GDF-9)[28],也通过激活Smad2/3来调控卵母细胞成熟;抑制型Smad (I-Smad)通过与Smad2/3竞争结合tgfbr1抑制TGF-β信号的传递[29-30]。但更为深入的机制还需要进一步研究和探索。

      Smad2蛋白是Smads家族中的受体调节型蛋白,在调控卵巢发育方面发挥着重要作用,研究Smad2的亚细胞定位对于理解其本身的功能及整个TGF-β信号通路的功能至关重要[31]。本研究发现,正常光周期条件下在斑马鱼卵母细胞发育的各个阶段均可检测到激活的Smad2蛋白。在PV期p-Smad2主要定位在细胞核内,在FG期p-Smad2主要定位在细胞质及细胞膜上,且在FG期卵母细胞中,阳性p-Smad2信号强度高于前期阶段的卵母细胞,提示Smad2在斑马鱼不同发育阶段的卵母细胞中发挥的功能不一致。此外,Kohli等[12]、Wang和Ge [32]在转录水平检测到斑马鱼滤泡细胞中smad2表达,本实验结果进一步发现Smad2蛋白在斑马鱼滤泡细胞中被激活,这表明Smad2对于斑马鱼卵母细胞的生长与成熟过程具有关键作用。但不同光周期处理并未影响到p-Smad2在斑马鱼卵母细胞中的定位。

      综上,本研究通过分析比较不同光周期条件下TGF-β/Smad信号通路所涉及的11个基因在斑马鱼卵巢中的表达变化,发现tgfb3、tgfbr2atgfbr2btgfbr1bsmad2和smad3a的表达模式一致,证实光周期变化可能通过改变tgfb3/受体 (tgfbr2atgfbr2b tgfbr1b)/蛋白激酶 (smad2和smad3a)基因的转录水平影响斑马鱼卵巢发育,具体的调控机制还需进一步研究。

参考文献 (32)

目录

    /

    返回文章
    返回