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斑节对虾TRIAP1基因的克隆、表达分析以及调控其表达的miRNAs的筛选

刘恩瑞 赵超 王鹏飞 范嗣刚 闫路路 邱丽华

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斑节对虾TRIAP1基因的克隆、表达分析以及调控其表达的miRNAs的筛选

    作者简介: 刘恩瑞(1992—),男,硕士研究生,从事海洋生物功能基因研究。E-mail:liuyi9241@yahoo.com.cn;
    通讯作者: 邱丽华, qiugroup_bio@outlook.com
  • 中图分类号: S 917.4

Cloning, expression analysis of TRIAP1 and its related miRNAs screening in Penaeus monodon

    Corresponding author: Lihua QIU, qiugroup_bio@outlook.com
  • CLC number: S 917.4

  • 摘要: 凋亡抑制因子1(tumor protein p53 regulated inhibitor of apoptosis 1, TRIAP1)可以通过抑制细胞凋亡参与生物体内应激反应。为探究TRIAP1基因及调控其表达的miRNAs在斑节对虾(Penaeus monodon)中应对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激的表达调控情况,本研究通过RACE技术获得了斑节对虾TRIAP1基因(PmTRIAP1)cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对PmTRIAP1在斑节对虾不同组织中的表达分布模式,以及哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1与相关miRNAs的表达关联情况进行了探究。结果显示,PmTRIAP1 cDNA全长2 522 bp,包括11 bp的5'非编码区(UTR)、2 289 bp的3'UTR和222 bp的开放阅读框(ORF),共编码73个氨基酸。PmTRIAP1基因在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高;哈氏弧菌刺激下,PmTRIAP1表达量显著降低,而Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p表达量显著升高,表明PmTRIAP1和Pm-miR-145-3p、Pm-miR-454-3p的表达量呈负相关关系;双荧光素酶报告实验结果显示,Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p可通过结合PmTRIAP1 3'UTR降低荧光素酶活性,表明Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p均可靶向调控PmTRIAP1的表达。
  • 图 1  PmTRIAP1的核酸和氨基酸序列

    Figure 1.  Nucleotide and deduced amino acid sequences of PmTRIAP1

    图 2  PmTRIAP1和其他物种TRIAP1氨基酸序列多重比对

    Figure 2.  Multiple alignment of deduced amino acid sequences of TRIAP1 from P. monodon and other species

    图 3  基于PmTRIAP1氨基酸序列的NJ系统进化树

    Figure 3.  NJ phylogenetic tree based on PmTRIAP1 amino acid sequences

    图 4  PmTRIAP1在各个组织中的相对表达

    Figure 4.  Relative expression of PmTRIAP1 in different tissues

    图 5  哈氏弧菌注射后PmTRIAP1在血细胞(A)和肝胰腺(B)中的相对表达量

    Figure 5.  Relative expression levels of PmTRIAP1 in hemocyte (A) and hepatopancreas (B) after V. harveyi challenge

    图 6  哈氏弧菌注射后Pm-miR-145-3p(A)和Pm-miR-454-3p(B)在血细胞中的相对表达量

    Figure 6.  Relative expression level of Pm-miR-145-3p (A) and Pm-miR-454-3p (B) in hemocyte after V. harveyi challenge

    图 7  Pm-miR-454-3p和Pm-miR-145-3p与靶基因PmTRIAP1 3’-UTR结合位点序列信息

    Figure 7.  Sequence information of binding and mutant sites of each miRNA at the 3'-UTR of target genes

    图 8  miRNAs与靶基因PmTRIAP1间互作关系的双荧光素报告验证实验

    Figure 8.  Interaction between miRNAs and PmTRIAP1 validated by dual-luciferase reporter assays

    表 1  实验所用引物

    Table 1.  Sequences of primers used in this study

    引物名称
    primer name
    序列(5'−3')
    sequence
    用途
    application
    TRIAP1-F ATGAACAGTGTGAGCAAGGATT 开放阅读框验证
    TRIAP1-R CTATTCCTTCGGCTTTTCTTCCG 开放阅读框验证
    TRIAP1-3GSP1 GGAGGAAGAAAACGCTGGCAGTGG 3' RACE 扩增
    TRIAP1-3GSP2 TGCAGCTGAGCTTGAGACCCAAAA 3' RACE 扩增
    qTRIAP1-F TGAACAGTGTGAGCAAGGATT PmTRIAP1 RT-PCR
    qTRIAP1-R AGTGCTTCTTGGACACAGCTTTGG PmTRIAP1 RT-PCR
    EF-1α-F AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT RT-PCR 参照基因
    EF-1α-R CGTGGTGCATCTCCACAGACT RT-PCR 参照基因
    qmiR-145-F GGATTCCTGGAAATACTG miR-145 RT-PCR
    qmiR-454-F TAGTGCAATATTGGCTA miR-454 RT-PCR
    qmiR-R CAGTGCGTGTCGTGGAGT miRNAs RT-PCR
    U6-S CTCGCTTCGGCAGCACA RT-PCR 内参基因
    U6-A AACGCTTCACGAATTTGCGT RT-PCR 内参基因
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    表 2  Targetscan,miRanda和Mireap筛选出2个miRNAs

    Table 2.  Two miRNAs screened by Targetscan,miRanda and Mireap

    miRNA名称
    miRNA name
    序列(5'−3')
    sequence
    Pm-miR-145-3p GGATTCCTGGAAATACTGTTCT
    Pm-miR-454-3p TAGTGCAATATTGCTAATAGGCT
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-12-18
  • 录用日期:  2019-04-05
  • 网络出版日期:  2019-05-07

斑节对虾TRIAP1基因的克隆、表达分析以及调控其表达的miRNAs的筛选

    作者简介:刘恩瑞(1992—),男,硕士研究生,从事海洋生物功能基因研究。E-mail:liuyi9241@yahoo.com.cn
    通讯作者: 邱丽华, qiugroup_bio@outlook.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所,农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学,水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306
  • 3. 农业农村部水生动物基因组学重点实验室,北京 100141

摘要: 凋亡抑制因子1(tumor protein p53 regulated inhibitor of apoptosis 1, TRIAP1)可以通过抑制细胞凋亡参与生物体内应激反应。为探究TRIAP1基因及调控其表达的miRNAs在斑节对虾(Penaeus monodon)中应对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激的表达调控情况,本研究通过RACE技术获得了斑节对虾TRIAP1基因(PmTRIAP1)cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对PmTRIAP1在斑节对虾不同组织中的表达分布模式,以及哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1与相关miRNAs的表达关联情况进行了探究。结果显示,PmTRIAP1 cDNA全长2 522 bp,包括11 bp的5'非编码区(UTR)、2 289 bp的3'UTR和222 bp的开放阅读框(ORF),共编码73个氨基酸。PmTRIAP1基因在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高;哈氏弧菌刺激下,PmTRIAP1表达量显著降低,而Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p表达量显著升高,表明PmTRIAP1和Pm-miR-145-3p、Pm-miR-454-3p的表达量呈负相关关系;双荧光素酶报告实验结果显示,Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p可通过结合PmTRIAP1 3'UTR降低荧光素酶活性,表明Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p均可靶向调控PmTRIAP1的表达。

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