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华贵栉孔扇贝MSTN基因启动子的功能分析

范嗣刚 赵超 王鹏飞 闫路路 邱丽华

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华贵栉孔扇贝MSTN基因启动子的功能分析

    作者简介: 范嗣刚(1982—),男,博士,助理研究员,从事海洋生物功能基因研究。E-mail: fansigang@scsfri.ac.cn;
    通讯作者: 邱丽华, qiugroup_bio@outlook.com
  • 中图分类号: S 917.4

Functional analysis of MSTN promoter in scallop (Chalmys nobilis)

    Corresponding author: Lihua QIU, qiugroup_bio@outlook.com
  • CLC number: S 917.4

  • 摘要: 为了解肌肉生长抑制素myostatin (MSTN)在华贵栉孔扇贝(Chalmys nobilis)闭壳肌肌肉生长和发育过程中所起的负调控作用,对华贵栉孔扇贝的MSTN启动子序列进行了生物信息学分析。结果显示,MSTN启动子序列长1 358 bp,有4个转录起始位点。核心启动子区为–100~–51 bp。有1个TATA-box (–92~–86 bp)和2个E-box等顺式作用元件;潜在的转录因子结合位点有MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD等;启动子区域无CpG岛。成功构建了6个MSTN启动子不同长度片段的荧光素酶表达载体,瞬时转染到293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,表明6个启动子片段均有转录活性,PGL-534的活性最高,其次为PGL-274、PGL-22和PGL-102,最低的为PGL-995。–216~–364区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点,–364~–825区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点。
  • 图 1  MSTN启动子序列分析

    Figure 1.  Analysis of MSTN gene promoter sequence

    图 2  MSTN基因启动子不同长度片段的扩增电泳图

    Figure 2.  Electrophoretograms of MSTN gene promoter with different lengths

    图 3  MSTN启动子不同长度片段的相对活性

    Figure 3.  Relative luciferase activity of MSTN gene with different lengths

    表 1  实验所用引物

    Table 1.  Primers used in this experiment

    引物
    primer
    序列 (5'−3')
    sequence
    PGL-22 CGGggtaccACACGGCGAAAAAATGGAGC
    PGL-102 CGGggtaccGGATGCCATAAATCAAAACCACAAC
    PGL-274 CGGggtaccAAAACGCCGCCAAACG
    PGL-534 CGGggtaccACTTCAGGCTGTATCGCAAAT
    PGL-995 CGGggtaccACCCGTTGGCAGCGTTCA
    PGL-1143 CGGggtaccTCTAAATGCTAACCCTTGTGCTG
    P1322A CTAaagcttTATAGCGGTTACGTTACAGATGGTT
     注:小写字体为酶切位点  Note: Lowercase letters represent restriction enzyme loci.
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-08-16
  • 录用日期:  2018-09-15
  • 网络出版日期:  2018-12-14
  • 刊出日期:  2019-02-01

华贵栉孔扇贝MSTN基因启动子的功能分析

    作者简介:范嗣刚(1982—),男,博士,助理研究员,从事海洋生物功能基因研究。E-mail: fansigang@scsfri.ac.cn
    通讯作者: 邱丽华, qiugroup_bio@outlook.com
  • 中国水产科学研究院南海水产研究所,广东省渔业生态环境重点实验室,农业农村部水产品加工重点实验室,广东 广州 510300

摘要: 为了解肌肉生长抑制素myostatin (MSTN)在华贵栉孔扇贝(Chalmys nobilis)闭壳肌肌肉生长和发育过程中所起的负调控作用,对华贵栉孔扇贝的MSTN启动子序列进行了生物信息学分析。结果显示,MSTN启动子序列长1 358 bp,有4个转录起始位点。核心启动子区为–100~–51 bp。有1个TATA-box (–92~–86 bp)和2个E-box等顺式作用元件;潜在的转录因子结合位点有MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD等;启动子区域无CpG岛。成功构建了6个MSTN启动子不同长度片段的荧光素酶表达载体,瞬时转染到293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,表明6个启动子片段均有转录活性,PGL-534的活性最高,其次为PGL-274、PGL-22和PGL-102,最低的为PGL-995。–216~–364区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点,–364~–825区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点。

English Abstract

  • 华贵栉孔扇贝(Chalmys nobilis)具有生长快、产量高、养殖周期短等特点,是中国华南沿海地区主要的海水养殖贝种之一,具有重要的经济价值。闭壳肌是华贵栉孔扇贝主要的食用部分。目前对扇贝闭壳肌的研究较少,主要有闭壳肌与其他性状的相关性研究,如墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)体质量和壳长与闭壳肌质量紧密相关[1];华贵栉孔扇贝软体部质量对闭壳肌质量的直接影响最大,其次是壳宽[2];影响虾夷扇贝(C. farreri)闭壳肌质量的主要因素是壳宽[3];另外闭壳肌颜色和蛋白分布也有涉及[4-5]。但很少见到闭壳肌生长和发育的相关研究。

    肌肉生长抑制素myostatin (MSTN)是转化生长因子-β (transforming growth factor-beta)超家族的成员,在动物肌肉生长和发育过程中起负调控作用[6]。Myostatin蛋白包括1个分泌信号序列、蛋白水解处理位点、含有9个半胱氨酸残基的保守型羧基末端区[7-8]。Myostatin的前体蛋白由信号序列、N-末端前肽区域和1个活性配基的C-末端区域组成[7-8]。前体蛋白经过2次蛋白质水解切割后,Myostatin即可活化[8-9]。成熟的Myostatin蛋白是一个C-末端由二硫键连接的二聚体,与MSTN基因受体结合,从而发挥其生物活性[8-9]

    目前在海湾扇贝(A. irradians)、栉孔扇贝 (C. farreri)、华贵栉孔扇贝、贻贝(Mytilus chilensis)、小狮爪海扇蛤(Nodipecten subnodosus)和竹蛏(Sinonovacula constricta)等贝类中有myostatin基因的研究报道[10-16]。Morelos等[14]研究1龄小狮爪海扇蛤一年中myostatin在闭壳肌中的表达情况、闭壳肌质量和肌纤维数量和大小,证实myostatin表达和闭壳肌性状有关联。在一些贝类中发现MSTN有与生长性状相关联的SNP位点[15,17-18]。Hu等[11]预测了栉孔扇贝MSTN启动子中有MEF2、COMP、MTBF、E-box等调控元件。

    笔者已获得了华贵栉孔扇贝MSTN启动子序列[16]。本研究拟对启动子序列进行生物信息学分析。通过构建不同缺失长度的报告基因系统,检测启动子的转录活性,为今后进一步研究MSTN基因的调控机制奠定基础。

    • 华贵栉孔扇贝采购于广东深圳南澳,剪取其闭壳肌组织,液氮冷冻后放置于– 80 ℃冰箱保存。

    • 用海洋动物DNA提取试剂盒(天根)提取DNA,终质量浓度为50 ng·mL–1,– 20 ℃保存备用。

    • 笔者已获得myostatin基因启动子序列[16]。用在线软件BDGP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测核心启动子区域和转录起始位点(transcription start site,TSS)。用MatInspector软件预测潜在的转录因子结合位点。用MethPrimer软件(http://www.urogene.org/methprimer2/)预测CpG岛。

    • 根据潜在的转录因子结合位点分析结果,设计6个正向引物和1个反向引物。上、下游引物分别添加KpnⅠ和HindⅢ酶切位点和保护碱基(表1)。以PGL-22为正向引物,P1322A为反向引物,扩增出最长的启动子片段,胶回收后,连接到pMD18-T载体,转化到DH5α大肠杆菌中,挑单克隆菌送上海生工生物工程有限公司测序。测序正确后,用质粒提取试剂盒(生工)提取质粒,以质粒DNA为模板,分别以PGL-102、PGL-274、PGL-534、PGL-995和PGL-1143为正向引物,P1322A为反向引物,通过PCR扩增不同片段长度的MSTN基因启动子片段,随后连接转化,测序验证序列正确后提取质粒。

      引物
      primer
      序列 (5'−3')
      sequence
      PGL-22 CGGggtaccACACGGCGAAAAAATGGAGC
      PGL-102 CGGggtaccGGATGCCATAAATCAAAACCACAAC
      PGL-274 CGGggtaccAAAACGCCGCCAAACG
      PGL-534 CGGggtaccACTTCAGGCTGTATCGCAAAT
      PGL-995 CGGggtaccACCCGTTGGCAGCGTTCA
      PGL-1143 CGGggtaccTCTAAATGCTAACCCTTGTGCTG
      P1322A CTAaagcttTATAGCGGTTACGTTACAGATGGTT
       注:小写字体为酶切位点  Note: Lowercase letters represent restriction enzyme loci.

      表 1  实验所用引物

      Table 1.  Primers used in this experiment

      KpnⅠ和HindⅢ2种内切酶同时在37 ℃水浴酶切含有不同长度片段的pMD18-T重组质粒和pGL3-basic质粒,分别纯化后,用Solution I连接酶(TaKaRa) 16 ℃连接过夜,转化到DH5α大肠杆菌中,用去内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA)提取重组质粒,测序以验证序列是否正确。

    • 在24孔培养板中接种HEK293T细胞,使转染时细胞密度在70%~80%。所用培养基为DMEM高糖培养基(Hyclone),加入10% FBS (Gibco)。细胞放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养约20 h。

    • 内参质粒为pRL-TK (Promega),分别将各pGL3-basic重组质粒和内参质粒以20∶1的比例共转染到细胞。转染对照组为pGL3-basic载体和pRL-TK载体。每组做5个平行。瞬时转染采用转染试剂盒Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen),根据试剂盒的说明进行实验。

    • 用萤光素酶检测试剂盒Dual-Luciferase®Reporter Assay System(Promega)分析报告基因Luciferase活性。转染24 h后,吸去旧的培养基,加入1×PBS清洗1~2次,吸出PBS后,每孔中加入细胞裂解液PLB (passive lysis buffer,Promega) 200 μL,室温孵育10 min;将裂解液10 000 r·min–1离心5 min,取上清作为待测液;取100 μL裂解液上清加入96孔发光板中,加入100 μL萤火虫荧光素酶检测工作液(碧云天),吹吸混匀;上机测发光值,积分时间5 s;加入海肾荧光素酶检测工作液(碧云天) 100 μL,吹吸混匀,用化学发光分析仪BK-L96C (中生北控)监测发光值。用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析检测各样品间差异的显著性。

    • 华贵栉孔扇贝MSTN基因5'调控区序列长1 358 bp (GenBank登录号:KY888888)。BDGP预测有4个TSS,分别为位于ATG上游第70个碱基“A”,第233个碱基“G”,第1 059个碱基“A”和第1 299个碱基“T”(图1)。核心启动子区在–100~–51 bp。MatInspector在线软件分析潜在的转录因子结合位点包括MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD等,存在1个TATA-box (位于–92~–86bp)和2个E-box顺式作用元件 (图1)。MethPrimer软件预测无CpG岛。

      图  1  MSTN启动子序列分析

      Figure 1.  Analysis of MSTN gene promoter sequence

    • 6个正向引物(PGL-22、PGL-102、PGL-274、PGL-534、PGL-995和PGL-1143)和1个下游引物(P1322A)分别扩增出6个长度不同的启动子片段,长度依次为1 301 bp、1 221 bp、1 049 bp、789 bp、328 bp和180 bp (图2)。构建的pGL3-basic重组质粒名字与正向引物名字一一对应,即PGL-22、PGL-102、PGL-274、PGL-534、PGL-995和PGL-1143,经测序确定序列正确。

      图  2  MSTN基因启动子不同长度片段的扩增电泳图

      Figure 2.  Electrophoretograms of MSTN gene promoter with different lengths

    • 将构建的6个不同长度缺失片段pGL3-basic重组质粒分别与pRL-TK质粒共转染到HEK293T细胞。pGL3-basic空载体作为阴性对照。荧光素酶活性检测结果见图3,6个启动子片段的pGL3-basic重组载体与阴性对照pGL-basic空载体相比,荧光强度均有显著性差异(P<0.05)。除PGL-22和PGL-274外,其他启动子片段的荧光强度彼此间均有显著性差异(P<0.05)。PGL-534的转录活性最高,其次为PGL-274、PGL-22和PGL-102,最低为PGL-995。

      图  3  MSTN启动子不同长度片段的相对活性

      Figure 3.  Relative luciferase activity of MSTN gene with different lengths

    • 启动子是基因的“开关”,决定着基因的活动。通过生物信息学预测启动子上的顺式作用元件和反式作用因子,是研究启动子结构和功能的基础。

      本研究对华贵栉孔扇贝MSTN启动子序列进行生物信息学分析,结果显示核心启动子区为–100~–51 bp。华贵栉孔扇贝MSTN启动子包含4个TSS,分别位于起始密码ATG上游的第70、第233、第1 059和第1 299个碱基。栉孔扇贝和人的MSTN启动子有3个TSS[11,19],但在牛中只有1个[20]。TATA-box是真核生物启动子中重要组成部分,在猪[21]、大黄鱼 (Larimichthys crocea)[22]、栉孔扇贝[11]和华贵栉孔扇贝MSTN启动子中均发现有1个TATA-box,金头鲷 (Sparus aurata) MSTN启动子有2个TATA-box[23]。在大黄鱼和金头鲷MSTN启动子中,还检测到CAAT-box,但在扇贝中均未发现。E-box (核心序列为5'-CANNTG-3')在以上物种MSTN启动子中均检测到,说明E-box在不同物种MSTN启动子区域具有保守性。E-box突变会降低启动子活性[24]。E-box能被生肌调控家族因子(myogenic regular factor,MRFs)中的碱基螺旋-环-螺旋(bHLH)结构特异性识别,从而调控MSTN的转录[25]

      华贵栉孔扇贝MSTN启动子中存在的转录因子结合位点有MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD。在其他物种中也发现有一样的转录因子结合位点,如在栉孔扇贝中发现MEF2和MTBF[11],在金头鲷中发现MEF2[23],在猪中发现MEF2和MyoD[21],在牛中发现MEF2、MyoD和FoxO1[26]。均为肌肉特异性相关的转录因子结合位点,参与MSTN基因的转录和表达[27-28]。MEF2广泛存在于肌肉细胞中,可与许多肌肉特异性基因的启动子结合[29]。MEF2有MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D等4种亚型。

      CpG岛主要存在于启动子或第一外显子中,在基因表达调控中起负调控作用。本研究未发现华贵栉孔扇贝MSTN启动子存在CpG岛,这与栉孔扇贝MSTN启动子的分析结果相同。

      报告基因是检测启动子活性的常用方法。本研究构建了6个不同缺失片段的启动子报告基因,发现它们都有转录活性。这些报告基因均包含核心启动子区域,说明预测的核心启动子区域结果可靠。6个不同缺失片段启动子的转录活性与启动子长度无关。如PGL-534的活性最高,但该序列并不是最长。这说明MSTN启动子序列中有的序列是促进该基因表达的调控元件,有的则是抑制该基因表达的调控元件。这些表达元件在一起产生作用,产生不同的转录活性。如PGL-1143转录活性比PGL-995的强,说明–216~–364 bp区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点;PGL-995的转录活性远低于PGL-534,说明–364~–825 bp区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点。这些推论还需要进一步研究证实。

(3)  表(1) 参考文献 (29) 相关文章 (20)

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