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响应面法优化末水坛紫菜蛋白酶解工艺及其酶解液抗氧化活性研究

王小慧 戚勃 杨贤庆 杨少玲 马海霞 邓建朝

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响应面法优化末水坛紫菜蛋白酶解工艺及其酶解液抗氧化活性研究

    作者简介: 王小慧(1992— ),女,硕士研究生,从事水产品加工与质量安全研究。E-mail: 2289122030@qq.com;
    通讯作者: 杨贤庆, yxqgd@163.com
  • 中图分类号: S 985.4+2

Optimization of enzymatic hydrolysis of protein in abandoned Porphyra haitanensis by response surface methodology and study on antioxidant activity of its hydrolysate

    Corresponding author: Xianqing YANG, yxqgd@163.com ;
  • CLC number: S 985.4+2

  • 摘要: 为实现末水坛紫菜(Porphyra haitanensis)的高值化利用,研究了末水坛紫菜的蛋白酶解工艺及其酶解液的抗氧化活性。以酶解产物水解度和还原力为指标,分别采用单因素和响应面优化实验筛选出最适蛋白酶和最佳酶解工艺参数;通过测定酶解液还原力对1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(${\rm{O}}_2^- $·)的清除作用,研究了最高水解度下的酶解液的抗氧化性活性。结果表明,中性蛋白酶是6种蛋白酶中的最适用酶;最佳酶解条件为:底物质量浓度35 g·L−1、加酶量31 200 U·g−1、温度45 ℃、pH 7.6、酶解时间5 h,在此条件下坛紫菜水解度达31.37%;酶解液还原力为2.2,对DPPH、·OH和${\rm{O}}_2^-$·自由基清除率分别为56.26%、85.84%和72.73%。结果表明,中性蛋白酶可以有效水解末水坛紫菜,水解后的酶解产物具有较好的抗氧化能力和应用前景。
  • 图 1  不同酶酶解时间对水解度 (a) 和还原力 (b) 的影响

    Figure 1.  Effect of enzymolysis time of different enzymes on degree of hydrolysis (a) and reducing power (b)

    图 2  pH (a)、酶解温度 (b)、底物质量浓度 (c)、酶解时间 (d) 和加酶量 (e) 对水解度和还原力的影响

    Figure 2.  Effects of pH (a), hydrolysis temperature (b), substrate mass concentration (c), hydrolysis time (d) and enzyme dosage (e) on degree of hydrolysis and reducing power

    图 3  Y=(AB)的响应面与等高线

    Figure 3.  Response surface and contour plots under Y=(A, B)

    图 5  Y=(AC)的响应面与等高线

    Figure 5.  Response surface and contour plots under Y=(A, C)

    图 4  Y=(BC)的响应面与等高线

    Figure 4.  Response surface and contour plots under Y=(B, C)

    表 1  不同蛋白酶的酶解条件

    Table 1.  Hydrolysis condition of different proteases

    蛋白酶种类
    kinds of protease
    酶活性/U·mg−1
    enzyme activity
    pH 温度/℃
    temperature
    中性蛋白酶 neutral protease 100 7 50
    胰蛋白酶 trypsin 250 8 50
    复合蛋白酶 compound protease 120 7 50
    木瓜蛋白酶 papain 6 000 7 50
    风味蛋白酶 flavored proteinase 40 7 50
    菠萝蛋白酶 bromelain 100 7 50
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    表 2  响应面实验因素水平表

    Table 2.  Factors and levels of response surface experiment

    水平 level 因素 factor
    温度 (A) /℃
    temperature
    pH (B) 加酶量 (C) /U·g−1
    enzyme dosage
    −1 40 6 24 960
    0 45 7 28 800
    1 50 8 32 640
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    表 3  响应面实验设计及结果

    Table 3.  Experimental results of Box-Behnken design

    序号 No. 温度 (A)
    temperature
    pH (B) 加酶量 (C)
    enzyme dosage
    Y/%
    1 1 −1 0 23.43
    2 −1 0 −1 22.03
    3 0 −1 −1 22.57
    4 0 0 0 29.94
    5 0 0 0 30.33
    6 0 −1 1 25.51
    7 1 1 0 28.45
    8 0 1 −1 24.50
    9 0 1 1 29.99
    10 1 0 1 27.97
    11 0 0 0 29.53
    12 1 0 −1 23.80
    13 −1 0 1 27.31
    14 0 0 0 28.57
    15 0 0 0 29.41
    16 −1 −1 0 23.70
    17 −1 1 0 26.58
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    表 4  回归与方差分析结果

    Table 4.  Analysis of variance for fitted regression model

    方差来源
    source of variation
    平方和
    SS
    自由度
    df
    均方
    MS
    F P
    prob>F
    显著性
    significance
    模型 model 129.33 9 14.37 44.69 <0.000 1 ***
    A 2.04 1 2.04 6.35 0.039 8 *
    B 25.60 1 25.60 79.63 <0.000 1 ***
    C 39.91 1 39.91 124.14 <0.000 1 ***
    AB 1.14 1 1.14 3.55 0.101 4
    AC 0.31 1 0.31 0.96 0.360 7
    BC 1.63 1 1.63 5.07 0.059 0
    A2 20.18 1 20.18 62.76 <0.000 1 ***
    B2 14.04 1 14.04 43.66 0.000 3 ***
    C2 18.34 1 18.34 57.05 0.000 1 ***
    残差 residual 2.25 7 0.32
    失拟项 lack of fit 0.50 3 0.17 0.38 0.772 3
    纯误差 pure error 1.75 4 0.44
    总和 sum 131.58 16
    R2 0.982 9
    注:***. P<0.001;*. P<0.05
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    表 5  坛紫菜酶解前后抗氧化能力的比较

    Table 5.  Comparison of antioxidant activity of P. haitanensis before and after hydrolysis

    抗氧化指标
    antioxidant index
    酶解前
    before hydrolysis
    酶解后
    after hydrolysis
    还原力 reducing power 0.7±0.01 2.2±0.006
    DPPH·清除率/%
    scavenging activity
    11.64±0.02 56.26±0.01
    ·OH清除率/%
    scavenging activity
    63.47±0.05 85.84±0.02
    ${\rm{O}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$·清除率/%
    scavenging activity
    58.36±0.07 72.73±0.03
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-05-14
  • 录用日期:  2018-10-08
  • 网络出版日期:  2018-12-10
  • 刊出日期:  2019-04-01

响应面法优化末水坛紫菜蛋白酶解工艺及其酶解液抗氧化活性研究

    作者简介:王小慧(1992— ),女,硕士研究生,从事水产品加工与质量安全研究。E-mail: 2289122030@qq.com
    通讯作者: 杨贤庆, yxqgd@163.com
  • 1. 广东海洋大学食品科技学院,广东 湛江 524000
  • 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业农村部水产品加工重点实验室,广东 广州 510300

摘要: 为实现末水坛紫菜(Porphyra haitanensis)的高值化利用,研究了末水坛紫菜的蛋白酶解工艺及其酶解液的抗氧化活性。以酶解产物水解度和还原力为指标,分别采用单因素和响应面优化实验筛选出最适蛋白酶和最佳酶解工艺参数;通过测定酶解液还原力对1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(\begin{document}${\rm{O}}_2^- $\end{document}·)的清除作用,研究了最高水解度下的酶解液的抗氧化性活性。结果表明,中性蛋白酶是6种蛋白酶中的最适用酶;最佳酶解条件为:底物质量浓度35 g·L−1、加酶量31 200 U·g−1、温度45 ℃、pH 7.6、酶解时间5 h,在此条件下坛紫菜水解度达31.37%;酶解液还原力为2.2,对DPPH、·OH和\begin{document}${\rm{O}}_2^-$\end{document}·自由基清除率分别为56.26%、85.84%和72.73%。结果表明,中性蛋白酶可以有效水解末水坛紫菜,水解后的酶解产物具有较好的抗氧化能力和应用前景。

English Abstract

  • 坛紫菜(Porphyra haitanensis)是一种分布在我国东南沿海的暖温性红藻,根据采收期的不同分为头水、二水、三水、四水等,其中末水坛紫菜(一般是六水)占紫菜总产量的10%以上[1]。我国每年末水坛紫菜产量约1×104 t,但由于末水坛紫菜色泽差、胶质含量多、韧性强、口感粗糙、利润低,养殖户常放弃对其采收,使之在海里腐烂,造成资源浪费和环境污染[2]。因此,有必要对末水坛紫菜进行精深加工和综合利用。

    与三水坛紫菜相比,末水坛紫菜的蛋白质和多糖含量较高,分别达35%和25%以上,是一种高蛋白、高膳食纤维、低脂肪、低热能的天然营养保健食品[3]。紫菜蛋白因其高含量和独特的生物学功能成为紫菜开发利用的研究热点[4]。紫菜通过酶解可使原来蛋白质的功能特性发生变化,这些特性的改变很大程度上取决于水解度(degree of hydrolysis,DH)的大小[5]。研究表明,随着水解度的增加,水解物的抗氧化能力逐渐增强[6]。因此,对酶解工艺进行优化十分重要。现已有对末水坛紫菜多糖的研究[7],但尚未见关于其蛋白质的研究报道。本研究以末水坛紫菜为原料,通过筛选蛋白酶,优化酶解工艺条件,研究酶解液的抗氧化活性,以期为末水坛紫菜的开发利用提供理论基础。

    • 末水坛紫菜由汕头大学南澳试验站赠送。1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)购自美国Sigma公司;中性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶购自广州华屿欣实验器材有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

    • BS224S分析天平(美国Sartorius公司);Titrando 809型自动电位滴定仪(瑞士万通公司);SPX-3k30高速冷冻离心机(德国Sigma公司);HH-4快速恒温数显水浴箱(常州澳华仪器有限公司);PB-10精密pH测试仪(德国Sartorius公司);XT-500A型粉碎机(永康红太阳机电有限公司);SHZ-82A水浴恒温振荡器(精达仪器制造有限公司);KjeltecTM2300型蛋白自动分析仪(丹麦Foss公司);Synergy H1型酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。

    • 干坛紫菜烘箱干制至水分含量4%,粉碎过筛,于干燥器保存。

    • 取一定量的紫菜粉和蛋白酶于锥形瓶中,按一定比例加入0.1 mol·L−1的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液酶解,完成后灭酶15 min,冷却后于4 ℃、10 000 r·min−1离心10 min,取上清液,即为酶解液。

    • 按照1.3.2所述流程操作,调整样品的加酶量均为17 280 U·g−1,底物质量浓度为25 g·L−1,以各种蛋白酶的最适酶解条件为依据,按照表1条件进行实验,测定水解度和还原力,选取合适的蛋白酶。

      蛋白酶种类
      kinds of protease
      酶活性/U·mg−1
      enzyme activity
      pH 温度/℃
      temperature
      中性蛋白酶 neutral protease 100 7 50
      胰蛋白酶 trypsin 250 8 50
      复合蛋白酶 compound protease 120 7 50
      木瓜蛋白酶 papain 6 000 7 50
      风味蛋白酶 flavored proteinase 40 7 50
      菠萝蛋白酶 bromelain 100 7 50

      表 1  不同蛋白酶的酶解条件

      Table 1.  Hydrolysis condition of different proteases

    • 根据预实验,选取对水解度和还原力有显著影响的5个因素进行单因素实验。

    • 应用Box-Behnken中心组合设计原理,取酶解温度(A)、pH (B)、加酶量(C)进行响应面实验。

    • 半微量凯氏定氮法[9]测定原料总氮含量;甲醛电位滴定法[10]测定氨基酸态氮含量;DH按式(1)计算。

    • 2 mL 0.2 mol·L−1的磷酸缓冲液(pH 6.6)加入2 mL样液和2 mL 1%的铁氰化钾溶液,混匀,50 ℃水浴20 min,急速冷却后加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液,混匀后10 000 r·min−1离心10 min,取2 mL上清液,加2 mL离子水和0.4 mL 0.1%的氯化铁溶液,混匀,50 ℃水浴保温10 min,700 nm处测吸光度。以去离子水代替样品作为空白对照调零。

    • 2 mL的0.15 mmol·L−1DPPH溶液加入2 mL样液,混匀,37 ℃避光水浴30 min,517 nm处测吸光度Ai;空白组和对照组分别为2 mL样液和DPPH溶液,各加2 mL 95%乙醇混合测得吸光度,分别记为AjA0

    • 1 mL样液加入0.3 mL 5 mmol·L−1邻二氮菲溶液,加0.2 mL 0.15 mol·L–1的磷酸盐缓冲液(pH 7.40)和0.3 mL 0.75 mmol·L−1的硫酸亚铁溶液,混匀,加入0.2 mL 体积分数为0.1%的过氧化氢(H2O2)溶液摇匀,37 ℃水浴1 h,536 nm处测其吸光度Ai;用去离子水代替样品测得吸光度Aj;用去离子水代替样品和过氧化氢溶液测得吸光度A0

    • 取2.8 mL 0.1 mol∙L−1三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(pH 8.2)加0.1 mL样液,混匀,25 ℃水浴l0 min,加入0.1 mL 3 mmol·L−1的邻苯三酚溶液,混匀,加入50 μL 10%抗坏血酸,混匀后于325 nm处测得吸光度AS。用去离子水代替样品测得吸光度A0

    • 采用Excel 2007整理实验数据,使用Design Expert 8.0.6、SPSS 20. 0软件作统计分析。每个实验重复3次,实验结果取平均值。

    • 随着酶解时间延长,水解度逐渐增大,5 h后基本趋于稳定。第5小时时,中性蛋白酶水解度最大(15.73%),其次为菠萝蛋白酶(13.16%)和风味蛋白酶(10.79%),三者差异显著(P<0.05,图1-a),这与梁晓芳等[15]对扇贝酶解条件的优化及其抗氧化性的研究结果相似。

      图  1  不同酶酶解时间对水解度 (a) 和还原力 (b) 的影响

      Figure 1.  Effect of enzymolysis time of different enzymes on degree of hydrolysis (a) and reducing power (b)

      随着酶解时间的延长,酶解产物的还原力先增大后减小。在酶解第3小时时达到最高,此时风味蛋白酶酶解产物的还原力最高(1.42),其次为中性蛋白酶(1.39),显著高于其他蛋白酶酶解产物的还原力(P<0.05,图1-b)。Klompong等[16]的结果也表明风味蛋白酶水解物具有较高的抗氧化活性。

      不同蛋白酶具有不同的酶切位点和酶解产物,因此酶解效果差异明显[17]。中性蛋白酶水解度最高,可能是由于其酶切位点较多,水解更彻底[18]。风味蛋白酶的还原力最好,可能是因其水解生成的肽段较小,得到大量具有抗氧化活性的小分子肽,提供电子的能力强[19-21]。水解3 h后,水解度仍缓慢增加,但还原力开始下降,可能是由于随着时间的延长,酶解液中具有抗氧化功能的肽类被降解[22]。综合考虑,选取中性蛋白酶为实验用酶。

    • 选取底物浓度25 g·L−1,加酶量17 280 U·g−1,pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,40 ℃条件下恒温震荡酶解5 h。

      水解度和还原力随着pH的升高而增大,pH超过7.0时水解度趋于平衡(2-a),这可能是因为中性蛋白酶对中性以及偏碱性环境有较强的适应性,该环境下酶分子与底物的结合率更高,底物蛋白的解离程度也更高。pH超过7.0时还原力略微下降,可能是释放的活性物质与紫菜蛋白竞争作为酶的反应底物[23]。因此,最适pH为7.0。

      图  2  pH (a)、酶解温度 (b)、底物质量浓度 (c)、酶解时间 (d) 和加酶量 (e) 对水解度和还原力的影响

      Figure 2.  Effects of pH (a), hydrolysis temperature (b), substrate mass concentration (c), hydrolysis time (d) and enzyme dosage (e) on degree of hydrolysis and reducing power

    • 选取底物质量浓度25 g·L−1,加酶量17 280 U·g−1,pH 7.0,酶解温度分别为35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃,恒温震荡酶解5 h。

      随着酶解温度的增加,水解度和还原力先增大后减小,45 ℃时水解度和还原力达最大值,分别为16.34%和1.30 (图2-b),这可能是因为在一定温度范围内,温度升高可提高酶的活性和底物转化速率,而当温度超过酶的最适温度范围后,酶结构会发生变化,延缓了酶解进程,酶解物活性成分减少[24]。因此,酶解温度选择45 ℃。

    • 选取加酶量17 280 U·g−1,底物质量浓度分别为5 g·L−1、15 g·L−1、25 g·L−1、35 g·L−1和45 g·L−1,pH 7.0,45 ℃条件下恒温震荡酶解5 h。

      水解度和还原力随着底物浓度的增加而增大,底物质量浓度超过35 g·L−1时水解度趋于平衡,还原力趋于降低(图2-c)。这可能是因为在一定底物浓度范围内,底物浓度的增加有利于蛋白酶与底物的结合,酶解物活性成分随之增加;当底物浓度过高时,反应体系过于黏稠,影响了蛋白酶的分散性和活性物质的释放[25]。因此,选择底物浓度为35 g·L−1

    • 选取底物质量浓度35 g·L−1,加酶量17 280 U·g−1,pH 7.0,酶解温度45 ℃,分别恒温震荡酶解1 h、3 h、5 h、7 h和9 h。

      水解度随时间的延长而增大,原因可能是反应初始阶段酶活力强,底物浓度大,酶解速度快;但酶解时间超过5 h便趋于平衡,可能是因为底物浓度减小,水解度增幅减缓[26]。还原力随时间的延长而增大,3 h后水解度还在增大而还原力则开始减小 (图2-d),可能是因为3 h后酶解液中具有抗氧化功能的肽类被降解,失去了生物活性[20]。考虑到3 h与5 h水解度差异显著(P<0.05)而还原力差异不显著(P>0.05),酶解时间选取5 h。

    • 选取底物质量浓度35 g·L−1,pH 7.0,加酶量分别为17 280 U·g−1、21 120 U·g−1、24 960 U·g−1、28 800 U·g−1和32 640 U·g−1,45 ℃条件下恒温震荡酶解5 h。

      水解度和还原力随加酶量的增加而增大,加酶量超过28 800 U·g−1时还原力趋于平衡,水解度趋于下降(图2-e)。原因可能是随着加酶量的增加,底物与酶的接触几率增大,水解程度和酶解产物随之增加,当加酶量超过一定量后底物质量浓度相对变低,酶分子过饱和,减缓了酶解进程[27]。综合考虑,选取加酶量为28 800 U·g−1

    • 本实验选取水解(Y)度为响应值,综合Box-Behnken中心设计原理,选取酶解温度(A)、pH (B)、加酶量(C) 3个响应变量,因素水平见表2,实验设计与结果见表3

      水平 level 因素 factor
      温度 (A) /℃
      temperature
      pH (B) 加酶量 (C) /U·g−1
      enzyme dosage
      −1 40 6 24 960
      0 45 7 28 800
      1 50 8 32 640

      表 2  响应面实验因素水平表

      Table 2.  Factors and levels of response surface experiment

      序号 No. 温度 (A)
      temperature
      pH (B) 加酶量 (C)
      enzyme dosage
      Y/%
      1 1 −1 0 23.43
      2 −1 0 −1 22.03
      3 0 −1 −1 22.57
      4 0 0 0 29.94
      5 0 0 0 30.33
      6 0 −1 1 25.51
      7 1 1 0 28.45
      8 0 1 −1 24.50
      9 0 1 1 29.99
      10 1 0 1 27.97
      11 0 0 0 29.53
      12 1 0 −1 23.80
      13 −1 0 1 27.31
      14 0 0 0 28.57
      15 0 0 0 29.41
      16 −1 −1 0 23.70
      17 −1 1 0 26.58

      表 3  响应面实验设计及结果

      Table 3.  Experimental results of Box-Behnken design

      利用统计软件Design Expert对数据进行多元回归拟合,得到回归方程:Y=29.56+0.51A+1.79B+2.23C+0.53AB−0.28AC+0.64BC−2.19A2−1.83B2−2.09C2,方差分析结果见表4。模型回归极显著(P<0.001),失拟项不显著(P>0.05),表明回归方程拟合度高,可以用来分析和预测酶解液的水解度。回归方程的决定系数(R2)为0.982 9,说明该模型水解度的实测值和预测值拟合良好,水解度与酶解温度、pH和加酶量之间线性关系显著。模型中一次项BC项的P<0.001,说明pH、加酶量对水解度有极显著影响,AP<0.05,说明酶解温度对水解度有较显著影响。由表4可见,F(A)=6.35,F(B)=79.63,F(C)=124.14。F值越大,对响应值的影响越显著,各因素对水解度的影响顺序为C (加酶量)>B (pH)>A (酶解温度)。

      方差来源
      source of variation
      平方和
      SS
      自由度
      df
      均方
      MS
      F P
      prob>F
      显著性
      significance
      模型 model 129.33 9 14.37 44.69 <0.000 1 ***
      A 2.04 1 2.04 6.35 0.039 8 *
      B 25.60 1 25.60 79.63 <0.000 1 ***
      C 39.91 1 39.91 124.14 <0.000 1 ***
      AB 1.14 1 1.14 3.55 0.101 4
      AC 0.31 1 0.31 0.96 0.360 7
      BC 1.63 1 1.63 5.07 0.059 0
      A2 20.18 1 20.18 62.76 <0.000 1 ***
      B2 14.04 1 14.04 43.66 0.000 3 ***
      C2 18.34 1 18.34 57.05 0.000 1 ***
      残差 residual 2.25 7 0.32
      失拟项 lack of fit 0.50 3 0.17 0.38 0.772 3
      纯误差 pure error 1.75 4 0.44
      总和 sum 131.58 16
      R2 0.982 9
      注:***. P<0.001;*. P<0.05

      表 4  回归与方差分析结果

      Table 4.  Analysis of variance for fitted regression model

      通过上述二次多项回归方程作响应面和等高线图,分别固定加酶量(C)、酶解温度(A)和pH (B)在原点,依次得到另外2个响应变量的响应面和等高线图(图3~图5)

      图  3  Y=(AB)的响应面与等高线

      Figure 3.  Response surface and contour plots under Y=(A, B)

      图  5  Y=(AC)的响应面与等高线

      Figure 5.  Response surface and contour plots under Y=(A, C)

      等高线形状为椭圆,响应面陡峭(图4),表明加酶量和pH的交互作用对水解度的影响较大[28]。等高线形状接近圆形,响应面平缓(图3图5),表明酶解温度和pH的交互作用、以及加酶量和酶解温度的交互作用对水解度的影响较小。该结论验证了回归与方差分析结果。

      图  4  Y=(BC)的响应面与等高线

      Figure 4.  Response surface and contour plots under Y=(B, C)

      采用Design Expert软件拟合实验结果,得出3个影响因素的最佳酶解条件为酶解温度45 ℃、pH 7.6、加酶量31 178.82 U·g−1,理论水解度为30.85%。取最佳酶解温度45 ℃、pH 7.6、加酶量31 200 U·g−1,在此优化条件下做3组平行实验,测得优化后的紫菜酶解液的水解度为31.37%,相对误差为1.7%,表明响应面法优化结果与实际值基本一致,对末水坛紫菜蛋白酶解工艺参数具有一定的实际预测价值。

    • 坛紫菜经过酶解,酶解液的抗氧化活性均有大幅度提高。与酶解前相比还原力提升了3倍多,DPPH·清除率提升了44.62%,·OH清除率提升了22.37%,${\rm{O}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$·清除率提升了14.37% (表5)。这是由于酶解过程中产生了一些抗氧化性更好的小分子肽[29-30]。酶解前原料就具有一定的抗氧化能力,这是由于紫菜本身含有一定量的黄酮、多酚、多糖等具有较高抗氧化活性的物质[31-33]

      抗氧化指标
      antioxidant index
      酶解前
      before hydrolysis
      酶解后
      after hydrolysis
      还原力 reducing power 0.7±0.01 2.2±0.006
      DPPH·清除率/%
      scavenging activity
      11.64±0.02 56.26±0.01
      ·OH清除率/%
      scavenging activity
      63.47±0.05 85.84±0.02
      ${\rm{O}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$·清除率/%
      scavenging activity
      58.36±0.07 72.73±0.03

      表 5  坛紫菜酶解前后抗氧化能力的比较

      Table 5.  Comparison of antioxidant activity of P. haitanensis before and after hydrolysis

    • 本文比较了6种酶对坛紫菜蛋白水解度和还原力的影响,结果表明中性蛋白酶为最适用酶。与热水浸提、酸碱提取、仪器辅助等手段相比,生物酶解具有条件温和、保护生物活性、副产物少等优点,紫菜通过生物酶解改变蛋白分子的大小构象及分子间/内作用力,从而改变其功能性[6]。不同蛋白酶具有不同的酶学性质,酶解产物抗氧化能力有显著差异,但均可有效破坏紫菜蛋白立体结构,暴露内部功能性基团[34]。在多种蛋白酶中,中性蛋白酶是一种内切酶,推测中性酶可将蛋白质水解成分子量合适的抗氧化多肽,促进肽键断裂使自由氨基、羧基和氨基酸残基浓度增加,从而获得高抗氧化活性[35]。通过单因素和响应面实验确定各因素对末水坛紫菜水解度的影响顺序为加酶量>pH>酶解温度,最佳酶解条件为:加酶量31 200 U·g−1,酶解温度45 ℃,酶解pH 7.6。优化后的紫菜酶解液的水解度为31.37%,其相对误差为1.7%;最优条件下坛紫菜酶解液的还原力达2.2,对DPPH、·OH和${\rm{O}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$·清除率分别为56.26%、85.84%和72.73%,具有良好的抗氧化活性。下一步可以对末水坛紫菜蛋白肽的分子量与抗氧化性关系进行探究。

参考文献 (35)

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