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  南方水产科学   2018, Vol. 14 Issue (5): 45-52.  DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.05.006
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余露军, 苗宗余, 蔡磊, 魏远征, 黄韧, 李建军. 诸氏鲻虾虎鱼“溃烂病”病原及其致病影响因子分析[J]. 南方水产科学, 2018, 14(5): 45-52. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.05.006.
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YU Lujun, MIAO Zongyu, CAI Lei, WEI Yuanzheng, HUANG Ren, LI Jianjun. Pathogenicity and impact factors of pathogen causing ulcer disease on Mugilogobius chulae [J]. South China Fisheries Science, 2018, 14(5): 45-52. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.05.006.
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资助项目

国家科技支撑计划项目(2015BAI09B05);广东省科技计划项目(2017B030314171,2017A070702001)

作者简介

余露军(1982 — ),男,硕士,工程师,从事水生实验动物微生物学研究。E-mail: ljyu1212@163.com

通信作者

李建军(1972 — ),男,硕士,高级工程师,从事水生实验动物学研究。E-mail: ljj@gdlami.com

文章历史

收稿日期:2018-03-01
修回日期:2018-04-23
诸氏鲻虾虎鱼“溃烂病”病原及其致病影响因子分析
余露军 , 苗宗余 , 蔡磊 , 魏远征 , 黄韧 , 李建军     
广东省实验动物监测所,广东省实验动物重点实验室,广东 广州 510663
摘要:为研究诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)“溃烂病”病原及其致病性,对患病鱼进行了病原分离、人工感染实验以及病原生理生化鉴定和gryB分析,研究了不同温度、盐度、pH条件对其致病性的影响。结果显示,病原菌为迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda),对诸氏鲻虾虎鱼和斑马鱼 (Danio rerio)的半致死剂量(LD50)分别为57 CFU·尾–1和2.0×104 CFU·尾–1,毒力基因(citCmukFesrBkatBfimAgadB)检测结果均为阳性,其基因序列与已知迟缓爱德华菌相应的毒力基因序列同源性高达99%。病理结果显示,患病鱼肾脏、肝脏、皮肤细胞均出现不同程度的变性、坏死和炎性细胞浸润等,其中肾和肝组织病变最为严重。25 ℃和30 ℃实验组5 d累计死亡率分别为(33±15)%、(60±10)%,显著高于20 ℃实验组和对照组 (P<0.05);盐度15和30实验组5 d累计死亡率分别为(60±10)%、(63±21)%,显著高于盐度3实验组 [(20±10)% ,P<0.05];而pH 6.0、pH 7.5、pH 9.0实验组之间5 d累计死亡率无显著差异 (P>0.05)。结果表明,迟缓爱德华菌是诸氏鲻虾虎鱼“溃烂病”病原,具有强致病性,养殖温度和盐度对其致病性具有显著影响。
关键词诸氏鲻虾虎鱼    迟缓爱德华菌    分离鉴定    致病性    影响因子    
Pathogenicity and impact factors of pathogen causing ulcer disease on Mugilogobius chulae
YU Lujun, MIAO Zongyu, CAI Lei, WEI Yuanzheng, HUANG Ren, LI Jianjun    
Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510663, China
Abstract: In order to investigate the pathogen and pathogenicity of ulcer disease of Mugilogobius chulae, we isolated the pathogenic bacteria from M.chulae for the artifical infection experiment, physiological and biochemical identification of pathogens and gryB analysis to determine if the environmental factors (temperature, salinity and pH) influence the pathogenicity of isolate strain EtMc1512. The results show that the pathogen was Edwardsiella tarda. The LD50s (lethal dose, 50%) of the isolate strain EtMc1512 to healthy M.chulae and Danio rerio were 57 CFU·ind–1 and 2.0×104 CFU·ind–1, respectively. The virulence-related genes (citC, mukF, esrB, katB, fimA, gadB) had been detected in strain EtMc1512, and the homology of their nucleotide between EtMc1512 and other E.tarda which were registered in GenBank was 99%. Cell degeneration, necrosis and inflammatory cell infiltration occurred with severe lesion in kidney and liver. The cumulative mortalities in high-temperature groups of 25 ℃ and 30 ℃ were significantly higher than those in low-temperature group of 20 ℃ and the control group (P<0.05). The cumulative mortality in low-salinity group of 3 was significantly lower than those in high-salinity groups of 15 and 30 (P<0.05). However, there was no significant difference in the cumulative mortality among different pH groups (6.0, 7.5 and 9.0,P>0.05). The results show thatE.tarda is a highly pathogenic pathogen of ulcer disease of M.chulae, and the environmental factors of temperature and salinity affect the virulence of E.tarda significantly.
Key words: Mugilogobius chulae    Edwardsiella tarda    isolation and identification    pathogenicity    impact factor    

诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)属于鲈形目、虾虎鱼亚目、虾虎鱼科、鲻虾虎鱼属,在中国主要分布于南海近海水域及入海口,为暖水性海洋小型鱼类,具有体形小、胚胎透明、繁殖量大、繁殖周期短等特点,是发展前景良好的海洋模式鱼类,已广泛应用于重金属[1-2]、环境内分泌干扰物[3]、钻井液[4]等海洋污染物的生态毒理评价。诸氏鲻虾虎鱼作为海洋鱼类实验动物,目前已对其开展染色体组型[5]、遗传标记[6]、营养需求[7]等质量控制研究,然而有关其病原微生物的研究较少,仅有创伤弧菌 (Vibrio vulnificus) 感染引起诸氏鲻虾虎鱼败血症的报道[8]。温度、盐度、pH是影响鱼类生长和免疫力的重要环境因子,相关报道已见于多种海、淡水鱼类[9-11],但对生长环境复杂的河口鱼类的影响尚未见报道。本文从患“溃烂病”的诸氏鲻虾虎鱼中分离优势菌,通过形态特征、生理生化及gryB序列分析鉴定为迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda),对其致病性、毒力基因、组织病理开展了相关研究,并探讨不同温度、盐度、pH条件下迟缓爱德华菌对诸氏鲻虾虎鱼致病性的影响,旨在为诸氏鲻虾虎鱼疾病防控及感染模型研究提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

从广州南沙采集诸氏鲻虾虎鱼样本进行病原分离。实验用诸氏鲻虾虎鱼为本实验室培育的封闭群(4~5月龄),体长(2.7±0.3) cm,养殖盐度25±2,温度(26±1) ℃,光照∶黑暗时间为14 h∶10 h;斑马鱼(Danio rerio)为本实验室繁殖的AB系野生群(6月龄),体长(2.6±0.2) cm,温度(26±1) ℃,光照∶黑暗时间为14 h∶10 h。脑心浸液培养基(Brian Heart Infusion Medium,BHI)购于北京陆桥公司,进行细菌分离、培养。

1.2 病原分离、纯化与人工感染

挑选肝脏部位溃烂穿孔的病鱼个体,无菌操作从肝脏部位取样划线接种于BHI平板,进行细菌分离,28 ℃恒温培养24 h后,选取优势菌落纯化培养。

新鲜培养的菌落用0.85%无菌生理盐水洗涤、重悬,麦氏比浊法稀释菌液至表1的浓度梯度,采用腹腔注射方式对诸氏鲻虾虎鱼和斑马鱼进行人工感染,注射剂量为0.02 mL·尾–1,同时设置生理盐水对照组。实验期间不投喂,水温(26±1) ℃,每天记录实验鱼的症状和死亡数量,采用概率单位加权回归法,通过SPSS 17.0软件计算感染后10 d的半致死剂量LD50 (lethal dose,50%)[12]。从感染后发病个体再次分离细菌,并进行回归感染。

1.3 细菌鉴定 1.3.1 生理生化鉴定

分离菌落先后通过形态观察、革兰氏染色、氧化酶反应及生化试验(API ID32E)进行鉴定。

1.3.2 分子生物学鉴定

新鲜培养的菌液按细菌基因组试剂盒(天根公司)提取DNA。采用刘春等[13]的方法对细菌gryB基因进行PCR扩增、纯化,并送上海生工进行测序。测序结果Blast分析后,选取相似序列利用MEGA 4.0软件构建系统发育树。

1.4 毒力基因分析

参照江云等[14]的方法对分离的菌株EtMC1512毒力基因(citCmukFesrBkatBfimAgadB)进行PCR检测。PCR产物测序、分析方法同1.3.2。

1.5 组织病理切片

将正常和患病的诸氏鲻虾虎鱼分别固定于4%多聚甲醛24 h,经脱钙、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色,中性树胶封片后显微观察。

1.6 不同温度、盐度、pH条件下迟缓爱德华菌对虾虎鱼的致病性

新鲜培养的菌液用无菌生理盐水稀释至2.1×103 CFU·mL–1。温度设20 ℃、25 ℃和30 ℃ 3个实验组(盐度15、pH 8.0);盐度设3、15和30 共3个实验组(温度25~26 ℃、pH 8.0);pH设6.0、7.5和9.0 共3个实验组(温度25~26 ℃、盐度15);并分别设置对应环境条件的对照组。实验组和对照组均为3个平行,每组10尾实验鱼,在实验条件下适应3 d后对实验鱼腹腔进行菌液注射(0.02 mL·尾–1),对照组注射生理盐水。连续观察5 d,每天记录死亡数量,实验期间不投喂,每天换1/3养殖水。5 d累计死亡率数据以“平均值±标准差( $ \overline X \pm {\rm SD}$ )”表示,SPSS 17.0软件进行显著性差异分析。

2 结果 2.1 临床症状及LD50

患病虾虎鱼腹部红肿、溃烂,严重者肝脏外露,解剖发现肝脏肿大。从病鱼分离到1株优势菌,编号EtMc1512。人工感染后鱼体腹部红肿,第3~第5天为死亡高峰,第4天出现肝脏部位溃烂穿孔个体,与自然发病症状相似,对照组10 d内无死亡。从典型症状鱼体肝脏再次分离病原,获得的菌株与EtMc1512形态和生化特征一致,且回归感染成功,表明菌株EtMc1512为诸氏鲻虾虎鱼“溃烂病”病原。

菌株EtMc1512对诸氏鲻虾虎鱼的LD50为57 CFU·尾–1,对斑马鱼的LD50为2.0×104 CFU·尾–1 (表1)。

表 1 诸氏鲻虾虎鱼和斑马鱼人工感染实验结果 Tab.1 Results of artificial infection of M.chulae and D.rerio
2.2 菌落形态及生理生化特性

分离菌株EtMc1512在BHI培养基28 ℃培养24 h后,菌落呈微黄色、边缘整齐、表面光滑湿润、直径约0.5~1.0 mm,革兰氏阴性,短杆菌,氧化酶阴性,API-ID32E鉴定结果为迟缓爱德华菌,鉴定率达99.9% (T为0.92),生理生化结果见表2

表 2 菌株EtMc1512生理生化实验结果 Tab.2 Physiological and biochemical results of EtMc1512
2.3 gryB基因序列分析

菌株EtMc1512 gryB基因PCR扩增获得1 500 bp左右的目的片段,序列Blast分析显示,EtMc1512 (登录号MG437051)与GenBank上登陆的迟缓爱德华菌(登录号JQ698509)同源性最高(99%)。菌株EtMc1512 gryB序列与相似序列构建系统发育树,EtMc1512的gryB序列与迟缓爱德华菌的gryB序列(登录号JQ698509)自然聚类(图1)。

图 1 基于gryB基因序列的系统发育树 节点处数值为自展重复1 000次的置信值 Fig.1 Phylogenetic tree based on gryB sequences The degree of confidence for each branch point was determined by bootstrap analysis (1 000 repetitions).
2.4 毒力基因检测

分离菌株EtMc1512毒力基因citCmukFesrBkatBfimAgadB PCR扩增分别获得大小为596 bp、356 bp、285 bp、558 bp、441 bp和582 bp的DNA片段,与预期结果一致。PCR产物测序、比对分析结果显示,分离株EtMc1512的6个毒力基因序列与迟缓爱德华菌相应的毒力基因同源性最高(99%,表3)。

表 3 菌株EtMc1512毒力基因比对分析结果 Tab.3 Comparison of virulence genes of strain EtMc1512
2.5 组织病理观察

肾组织可见明显的坏死病灶,大部分肾小管发生扩张、水肿,肾小管上皮组织与基底层分离,形成管型空腔(图2-b);病变严重的部位肾小管管腔结构完全破坏,肾小管上皮组织崩解,细胞离散,管腔内有大量坏死脱落的上皮细胞(图2-c)。

肝组织红细胞增多,肝血窦淤血(图2-e);肝细胞纤维变性,病变严重区域出现凝固性坏死病灶,细胞结构破坏(图2-f )。

皮肤上皮细胞变性,局部坏死、脱落(图2-h),大量炎性细胞浸润(图2-i )。

图 2 正常和发病诸氏鲻虾虎鱼的组织学变化 a. 正常的肾;b.肾小管上皮细胞与基底层分离,形成管型空腔,水肿(→);c. 肾小管扩张,有大量坏死脱落的上皮细胞 (→);d. 正常的肝;e. 肝血窦淤血(→);f. 肝细胞纤维素变性(→①),肝细胞变性、凝固性坏死(→② );g. 正常的皮肤;h. 皮肤上皮细胞变性,局部坏死、脱落(→);i. 炎性细胞浸润(→) Fig.2 Histological change of tissues of normal and diseased M.chulae a. normal kidney; b. the renal tubules epithelium separated from the basal layer to form a tubular cavity, edema (→); c. dilated renal tubules filled with desquamated epithelia (→); d. normal kidney; e. hepatic sinusoid congestion (→); f. cellulose degeneration (→①) and focal necrosis of liver (→②); g. normal skin; h. epithelial cells of skin showed degeneration and necrosis (→); i. inflammatory cell infiltration (→)
2.6 水质条件对迟缓爱德华菌致病性影响

不同温度条件下迟缓爱德华菌感染虾虎鱼后死亡情况见图3-a。高温实验组(30 ℃)在第2天首先出现死亡,且20~30 ℃时虾虎鱼5 d累计死亡率随温度升高而增加。20 ℃、25 ℃和30 ℃实验组5 d累计死亡率分别为(0±0)%、(33±15)%和(60±10)%;生理盐水对照组只有30 ℃组出现1尾死亡,20 ℃和25 ℃组均无死亡。25 ℃和30 ℃实验组5 d累计死亡率显著高于20 ℃实验组和对照组(P<0.05),30 ℃实验组5 d累计死亡率高于25 ℃实验组,但两者间并无显著性差异(P>0.05)。

不同盐度条件下迟缓爱德华菌感染虾虎鱼的死亡情况见图3-b。不同盐度组在前3 d死亡率无明显差异,但高盐度组从第4天开始死亡率明显上升。盐度3、15和30组5 d累计死亡率分别为(20±10)%、(60±10)%和(63±21)%,生理盐水对照组均无死亡。各盐度实验组5 d累计死亡率均显著高于对照组(P<0.05),盐度15和30组5 d累计死亡率显著高于盐度3组(P<0.05),盐度15和30组之间死亡率无显著性差异(P>0.05)。

不同pH条件下迟缓爱德华菌感染虾虎鱼的死亡情况见图3-c。pH 6.0、7.5和9.0实验组从第4天开始死亡率明显上升,5 d累计死亡率分别为(47±15)%、(30±10)%和(37±6)%,对照组均无死亡。pH实验组5 d累计死亡率均显著高于对照组(P<0.05),但pH 6.0~9.0的实验组5 d累计死亡率无显著性差异(P>0.05)。

图 3 不同温度 (a)、盐度 (b)和pH (c)下迟缓爱德华菌感染虾虎鱼的死亡率 Fig.3 Cumulative mortality of M.chulae after E.tarda challenge at different temperatures (a), salinities (b) and pH (c)
3 讨论

迟缓爱德华菌是对海淡水养殖造成严重危害的一种病原菌,已引起大菱鲆(Scophthalmus maximus)[15]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[16]、杂交鳢 [斑鳢(Channa maculata)♀×乌鳢(C.argus)♂][17]等多种经济鱼类疾病,造成重大的经济损失,同时也是斑马鱼[13]、剑尾鱼(Xiphophorus helleri)[18]等模式鱼类的病原。目前,国内外未见虾虎鱼科鱼类迟缓爱德华菌病的报道,本研究首次报道海洋模式鱼类诸氏鲻虾虎鱼迟缓爱德华菌病,分离菌株对诸氏鲻虾虎鱼的LD50为5.7×101 CFU·尾–1,表明该病原对诸氏鲻虾虎鱼具有强致病性,在养殖和实验过程中需要进行严格控制。从LD50来看,本研究分离的迟缓爱德华菌EtMc1512对诸氏鲻虾虎鱼的毒力远大于对斑马鱼的毒力(LD50为2.0×104 CFU·尾–1),表明诸氏鲻虾虎鱼可能是迟缓爱德华菌的天然敏感宿主,在迟缓爱德华菌毒力评价、替代感染模型等方面具有良好的应用前景。

组织病理学研究发现,迟缓爱德华菌引起诸氏鲻虾虎鱼肾脏、肝脏、肠道、皮肤等多种组织器官病变,属于全身性感染。其中肾脏、肝脏病变最为严重,表现为局部组织变性坏死,肾小管上皮细胞坏死、脱落、水肿,与基底层分离呈管型空腔;肝组织血细胞增多,肝细胞发生凝固变性和纤维变性,巨噬细胞增生。类似的组织病理变化在感染迟缓爱德华菌的大菱鲆[15]、鲶[19]组织病理学中也有发现,表明诸氏鲻虾虎鱼具有典型的迟缓爱德华菌感染病理症状,在感染模型病理评价时具有参考价值。此外,迟缓爱德华菌感染病理症状大多为肝脏型,也有少量肾脏型和肝肾混合型[15,20],从本研究结果来看,感染迟缓爱德华菌的诸氏鲻虾虎鱼肾脏和肝脏表现为易感器官,其病理变化较其他组织器官更为明显,因此本研究的诸氏鲻虾虎鱼迟缓爱德华菌病可能属于肝肾混合型。

迟缓爱德华菌是一种胞内寄生菌,其多毒力因子协同作用的致病机制尚未完全清晰[21]。Srinivasa Rao等[22]研究表明,毒力基因citCmukFesrBkatBfimAgadB仅在致病性迟缓爱德华菌菌株中存在。本研究发现从诸氏鲻虾虎鱼分离的迟缓爱德华菌菌株EtMc1512的6个毒力基因(citCmukFesrBkatBfimAgadB)检测结果均为阳性,且其序列与国外迟缓爱德华菌菌株同源性均为99%。而江云等[14]对国内来源的3株致病性迟缓爱德华菌毒力基因检测结果发现,仅citCmukFfimAgadB 4个毒力基因同时出现,未检测到esrBkatB基因,且所测菌株毒力基因部分序列与国外参考株序列同源性均低于90%。上述结果表明,我国迟缓爱德华菌毒力基因构成可能已随着国内环境的变化而发生改变,而国内外迟缓爱德华菌毒力基因是否趋于一致还需对更多菌株进行分析。esrB是迟缓爱德华菌T3SS分泌系统的关键调控基因,对其致病性有重要影响[23-25]katB基因能够对体外活性氧(reactive oxygen species,ROS)进行解毒,在感染过程中使细菌逃避宿主免疫防御,从而能够在巨噬细胞和鱼类体内存活[26]esrBkatB对迟缓爱德华菌致病性及致病机制的影响还有待进一步研究。

温度、盐度和pH是养殖水环境的重要理化指标,对病原菌和鱼体均有直接影响。本研究中感染迟缓爱德华菌的诸氏鲻虾虎鱼在20~30 ℃的死亡率随养殖温度上升而升高。Zheng等[27]研究表明,养殖温度(15~25 ℃)与迟缓爱德华菌毒力、增殖速度呈正相关,迟缓爱德华菌对牙鲆(Paralichthys olivaceus)的LD50随养殖温度上升而降低,与本研究结果趋势一致,表明养殖温度引起迟缓爱德华菌毒力和增殖速度的增加可能是导致诸氏鲻虾虎鱼死亡率上升的重要因素。值得注意的是,在本实验中20 ℃感染组未出现死亡,这可能是由于低剂量的病原菌(42 CFU·尾–1)在20 ℃时的增殖速度较慢,不足以对诸氏鲻虾虎鱼致死所致。此外,养殖温度也对鱼类免疫反应产生影响,其中温度影响鱼类血清溶菌酶活性的研究已有较多报道[10,28],温度还能引起鱼类血液IgM浓度和皮肤黏膜免疫相关蛋白的变化[29-30]。诸氏鲻虾虎鱼推荐养殖温度为24~26 ℃[7],本实验中诸氏鲻虾虎鱼随着温度的升高易感性增强,可能与温度升高引起诸氏鲻虾虎鱼自身免疫力下降有关,但其结果有待进一步研究确定。不同鱼类对盐度和pH的适应性有所不同,一般认为河口鱼类对盐度和pH具有较宽的适应范围[31]。广盐性鱼类随环境中盐度、pH的变化其内源性激素也随之改变,从而引起鱼类免疫反应的变化,但免疫因子变化规律因鱼类品种和规格不同而有所区别[32-34]。诸氏鲻虾虎鱼常栖息于河口、咸淡水水域,对盐度、pH适应范围广[5]。本实验中,中、高盐度(15和30)实验组诸氏鲻虾虎鱼死亡率显著高于低盐度(3)实验组(P<0.05),而pH 6.0~9.0各实验组诸氏鲻虾虎鱼死亡率无显著性差异(P>0.05),表明高盐度可能降低了诸氏鲻虾虎鱼的免疫反应,从而影响其对迟缓爱德华菌的易感性。综上,适当降低养殖温度和盐度对诸氏鲻虾虎鱼迟缓爱德华菌病的防控具有积极作用。

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